姚晶，任婧，吳正鈞，王蔭榆，郭本恒，

1(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)2(乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海，200436)

乳酸菌胞外多糖的生物合成及其遺傳調(diào)控*

姚晶1，任婧2，吳正鈞2，王蔭榆2，郭本恒1，2

1(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)2(乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海，200436)

作 為食品級(jí)的乳酸菌分泌的胞外多糖，由于其具有很多優(yōu)良的功能特性，成為了近年來的研究熱點(diǎn)。胞外多糖產(chǎn)量偏低限制了其工業(yè)化應(yīng)用，因此從基因水平上探索增加乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的途徑是大有裨益的。文中詳細(xì)闡述了胞外多糖的分類、結(jié)構(gòu)，同型多糖和異性多糖生物合成過程及其差異，以及在合成過程中的遺傳調(diào)控，并介紹了一些增加產(chǎn)量的有效調(diào)控手段，為深入的研究提供理論參考。

乳 酸菌，胞外多糖，生物合成，遺傳調(diào)控

胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)是一種微生物在生長過程中分泌到細(xì)胞外的長鏈多糖。以莢膜的形式附著在細(xì)胞表面的胞外多糖稱為莢膜多糖(capsular polysaccharides，CPS)，以黏液的形式分散在胞外環(huán)境中的胞外多糖稱為游離多糖(或黏液多糖)。很多微生物都能分泌EPS，尤其是乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)。LAB是公認(rèn)安全(generally recognized as safe，GRAS)的食品級(jí)微生物，EPS作為LAB重要的次生代謝產(chǎn)物，具有很高的研究和利用價(jià)值。20世紀(jì)40年代開發(fā)出的由腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)產(chǎn)生的右旋糖酐(dextrans)是最早被開發(fā)利用的乳酸菌胞外多糖，也是食品和藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的第一種食品級(jí)微生物胞外多糖。至今，人們已經(jīng)篩選出了多株產(chǎn)EPS的LAB。不同LAB菌株EPS的合成量是不同的，而EPS合成量的高低決定其發(fā)酵菌株是否適用于工業(yè)化生產(chǎn)。目前，對(duì)于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、生長因子等外部因素影響EPS合成量的報(bào)道已經(jīng)很多，而從LAB的遺傳和生理角度對(duì)其EPS合成量影響的報(bào)道甚是少見。深入理解和研究LAB基因簇對(duì)EPS的合成調(diào)控，可以從基因水平促進(jìn)EPS合成量的增加，從而實(shí)現(xiàn)EPS的工業(yè)化生產(chǎn)。本文系統(tǒng)闡述了LAB EPS相關(guān)的生物合成途徑、遺傳調(diào)控體系以及一些有效的調(diào)控手段。

1 產(chǎn)EPS的LAB菌株及其分類

1.1 產(chǎn)EPS的菌株

產(chǎn)EPS的LAB來源廣泛，絕大部分來源于乳制品，如［1］酸奶、Kefir制品、奶酪等，還有一些來源于發(fā)酵肉制品和蔬菜等。目前已經(jīng)報(bào)道的產(chǎn)EPS的LAB有［2］:嗜熱鏈球菌 (S.thermophilus)、嗜 酸 乳 桿菌(Lb.acidophilus)、干酪乳桿菌(L.casei)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lb.delbruec kii ssp.bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lb.helveticus)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lc.lactis ssp.cremoris)、乳酸乳球菌(Lc.lactis)、植物乳桿菌 (L.plantarum)、腸膜明串珠菌(Leuc.mesenteroides)、酒樣乳桿菌(L.kefiranofaciens)等等。其中研究較多的是［3］:嗜熱鏈球菌篩選菌株S.thermophilus EU20，NCFB2393，IMDO 01，SFi6，SFi39和Sfi12等;保加利亞乳桿菌(Lb.bulganicus)篩選菌株 L.bulganicus CNRZ 397，CNRZ 1187，CNRZ 416，Lb1，LY03等;乳酸乳球菌乳脂亞種篩選菌株L.lactis subsp.cremoris NIZO B35，NIZO B40，AHR 53等。

1.2 EPS的種類及其結(jié)構(gòu)

根據(jù)所在位置的不同，可以分為莢膜多糖和黏液多糖。莢膜多糖又可以分為:(1)大莢膜，簡稱莢膜，可在光學(xué)顯微鏡下看到，最低厚度為0.25 μm，具有相當(dāng)大的外部表面積;(2)微莢膜，厚度在0.2 μm以下，光學(xué)顯微鏡看不到，可用免疫學(xué)方法檢驗(yàn);(3)粘液層堆積在細(xì)胞表面，其多糖成分常滲入培養(yǎng)基中。粘液多糖可以進(jìn)入培養(yǎng)基形成黏液［4］。

根據(jù)合成位點(diǎn)和模式的不同，LAB EPS又可以分為同型多糖(homopolysaccharides，HoPS)和異型多糖(heteropolysaccharides，HePS)。HoPS含有4個(gè)亞基，即:(1)α-D-葡聚糖，主要由葡萄糖殘基以 α-1，6鍵連接，同時(shí)在3位有不同程度分支，在2位和4位上很少有分支;(2)β-D-葡聚糖，由葡萄糖以 β-1，3鍵連接，以β-1，2鍵形成分支;(3)果聚糖，主要由以β-2，6鍵連接的D-果糖分子組成;(4)其它，像聚半乳糖，它是由結(jié)構(gòu)一致的重復(fù)單體以不同的糖苷鍵連接組成的。HePS主要由嗜熱菌和嗜溫菌產(chǎn)生，由不同的糖單體組成，此類多糖由幾種糖單體共同組成糖單元進(jìn)一步連接而成，且每一個(gè)糖單元中包含有2種以上的單糖。通常組成LAB EPS的糖單體包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、海藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GlcNAc)和乙酰半乳糖(GalNAc)等。HePS的分子量在4×104～6×106u之間，而分子質(zhì)量的大小，又是EPS功能性質(zhì)的決定因素［5］。與 HoPS相比，其結(jié)構(gòu)更復(fù)雜些，不同的HePS，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元中單糖之間的連接方式也不同［3］。

EPS具有與蛋白質(zhì)類似的三維立體結(jié)構(gòu)，其一級(jí)結(jié)構(gòu)，即糖基的組成、糖基排列順序、相鄰糖基的連接方式、異頭碳構(gòu)型以及糖鏈有無分支、分支的位置等，決定了它的高級(jí)結(jié)構(gòu)。一級(jí)結(jié)構(gòu)中相對(duì)較小的變化都會(huì)引起 EPS空間構(gòu)型及其性質(zhì)的巨大改變［6］。LAB EPS中存在3種重要的結(jié)構(gòu)單元:(1)葡聚糖，主要是由α-1，6和α-1，3連接的葡聚糖殘基;(2)果聚糖，主要由β-2，6鍵連接的果糖分子;(3)四聚糖，一般由β-1，3鍵連接。隨著對(duì)LAB EPS研究的不斷深入，通過生化手段和分子生物學(xué)手段改變其一級(jí)結(jié)構(gòu)，從而定向生產(chǎn)出優(yōu)良性能的EPS，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

2 EPS的生物合成

EPS的生物合成因菌種不同而發(fā)生在生長的不同階段和環(huán)境條件下。按合成位點(diǎn)和合成模式的不同，分為位于細(xì)胞壁外的HoPS的合成與位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的HePS的合成。

2.1 HoPS的生物合成

HoPS，如葡聚糖(dextran)、果聚糖(levan)，是在LAB細(xì)胞外合成的。HoPS的合成可以在LAB培養(yǎng)液中，也可以在無細(xì)胞的酶液中進(jìn)行［7］。HoPS的合成體系包括糖基供體(蔗糖)、糖基受體(延長中的糖基鏈)及糖基轉(zhuǎn)移酶(如葡聚糖蔗糖酶，dextransucrase)。HoPS的合成是單鏈反應(yīng)，合成的能量來源于蔗糖的水解。高能態(tài)的糖基轉(zhuǎn)移酶是一個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)移酶，它將糖基供體的糖基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到糖基受體上，蔗糖可以啟動(dòng)自身的多聚化反應(yīng)。圖1所示的是葡聚糖的生物合成反應(yīng)。

2.2 HePS的生物合成

較HoPS的生物合成相比，HePS的生物合成過程比較復(fù)雜，涉及到多種酶與蛋白質(zhì)。HePS的生物合成是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)由許多復(fù)合體聚合而成的。典型的HePS合成途徑見圖2。由圖2可以看出，葡萄糖和乳糖是HePS的來源。葡萄糖-6-磷酸是糖酵解途徑和HePS合成途徑的關(guān)鍵中間產(chǎn)物:既可以經(jīng)磷酸己糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化形成果糖-6-磷酸，進(jìn)入糖酵解途徑，產(chǎn)生的ATP中一部分用于HePS的合成;又可以經(jīng)α-磷酸葡萄糖變位酶轉(zhuǎn)化形成葡萄糖-1-磷酸，進(jìn)入HePS合成途徑。葡萄糖-1-磷酸經(jīng)相關(guān)酶轉(zhuǎn)化形成HePS前體糖核苷酸，這些糖核苷酸發(fā)揮著重要的作用，不僅為聚合提供能量，而且可以激活糖基和促進(jìn)糖基的相變(如差向異構(gòu)、脫羧、脫氫等)。糖核苷酸前體在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，將第一個(gè)糖基加載在一種磷酸鹽脂載體上，隨后相關(guān)的一種或多種特異性糖基轉(zhuǎn)移酶按一定順序?qū)⑿碌奶腔虞d在不斷增長的重復(fù)單元上［7］，最終聚合成HePS，通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移分泌到胞外。目前重復(fù)單元的聚合機(jī)制以及聚合體的分泌輸出機(jī)制仍不是很清楚。但已有初步證據(jù)證明LAB中存在類異戊二烯脂載體［9］。圖3所示的是乳酸乳球菌乳脂亞種NIZO B40 HePS的生物合成模型。

通過和HoPS的合成體系比較可以發(fā)現(xiàn)，HePS的合成體系除了具有糖基供體(糖核苷酸)、糖基受體(增長中的重復(fù)單元)外，還包括脂載體、?；w及酶系統(tǒng)。脂載體整合多糖的重復(fù)單元;乙酸、丙酮酸、3-羥基丁酸等的活性形式是?；瑸榘舛嗵堑暮铣伤匦?酶系統(tǒng)包括己糖激酶、糖核苷酸合成及轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、聚合酶等。異型多糖的合成始于糖核苷酸的胞內(nèi)合成，之后糖核苷酸在液態(tài)載體中形成重復(fù)的單元，最后一步將重復(fù)單元聚合，并從細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，或者共價(jià)黏附在細(xì)胞，如莢膜多糖;或者分泌到環(huán)境中，如黏液多糖。

圖2 略修改的典型的HePS生物合成途徑［8］

圖3 乳酸乳球菌乳脂亞種NIZO B40 HePS的生物合成模型［10］

HePS的生物合成是一個(gè)耗能過程。前體糖核苷酸的合成，脂載體的磷酸化，重復(fù)單元的聚合及集合體轉(zhuǎn)移輸出都需要能量。而乳酸菌產(chǎn)生的能量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，這在很大程度上限制了HePS的產(chǎn)量。因此，在培養(yǎng)過程中增加過量水平的ATP可以大大提高EPS的產(chǎn)量。另外，糖核苷酸前體和類異戊二烯糖脂載體還參與細(xì)胞壁多聚物，如肽聚糖、磷壁酸、脂多糖等的生物合成。所以，糖核苷酸和類異戊二烯糖脂載體的濃度水平也是影響EPS產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，在細(xì)菌生長緩慢，細(xì)胞壁大分子的合成減少的情況下(如在低溫情況下)，HePS 的產(chǎn)量會(huì)提高［11－12］。此外，在HePS的生物合成過程中，涉及到大量的特異性糖基轉(zhuǎn)移酶和相關(guān)活性蛋白，可以通過提高糖基轉(zhuǎn)移酶及活性蛋白的濃度和活性水平，從而促進(jìn)其產(chǎn)量的增加。

3 EPS合成的遺傳調(diào)控

隨著LAB分子生物學(xué)研究的不斷深入，迄今已經(jīng)有22種乳酸菌基因組完成測序并公布，至少有12株的測序工作正在進(jìn)行中［13］。乳酸菌基因組在一個(gè)特定的范圍內(nèi)變化，從1.8～2.6 Mb不等，但是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的基因組相對(duì)較大，為3.3 Mb。雙歧桿菌和乳酸桿菌這兩種革蘭陽性菌分別具有較高和較低的GC含量，其中長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)的GC含量高達(dá)60.1%，而乳酸桿菌從30.9% ～50%不等［14］。

eps基因位于染色體或質(zhì)粒上，如嗜熱鏈球菌的eps基因位于染色體上;乳酸乳球菌乳脂亞種MS產(chǎn)EPS特性受一個(gè)大小為18.5Mu的質(zhì)粒的控制;干酪乳桿菌干酪亞種產(chǎn)EPS的特性受一個(gè)大小為4.5Mu的質(zhì)粒的控制;產(chǎn)EPS的德氏乳桿菌保加利亞亞種不含質(zhì)粒［15］。eps基因簇通常是單向排列，轉(zhuǎn)錄成單個(gè)多順反子mRNA，并協(xié)調(diào)表達(dá)。不同eps基因簇中基因的系統(tǒng)性、轉(zhuǎn)錄方向和推測的功能都具有高度的保守性。根據(jù)其同源性研究，eps基因簇分為四個(gè)功能區(qū)域［16］:中心區(qū)域，即編碼EPS重復(fù)單元生物合成過程中必需的特異性糖基轉(zhuǎn)移酶的基因;中心區(qū)域兩側(cè)的2個(gè)區(qū)域，它編碼了在聚合和輸出過程中控制鏈長、輸出和聚合的酶的基因;位于基因簇開頭的調(diào)控基因區(qū)域。

圖4顯示了4種不同的嗜熱鏈球菌菌株eps基因簇。通過比較可以發(fā)現(xiàn)，5＇端都存在編碼嘌呤核苷酸磷酸化酶的deoD基因，嘌呤核苷酸磷酸化酶作用于核苷酸的合成和分解反應(yīng)。5＇端的epsA-epsD在不同菌株之間顯示了高度的保守性:epsA、epsB是調(diào)控序列;epsC是聚合序列;epsD是跨膜運(yùn)輸序列，而且在不產(chǎn) EPS 的菌株中也發(fā)現(xiàn)了相同序列［16，19－20］。第 5個(gè)基因epsE編碼了糖基-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶，它參與EPS合成單元中的第1步:將己糖-1-磷酸加載到脂載體上。目前已經(jīng)證明至少有2種糖基轉(zhuǎn)移酶是由epsE編碼的，一種是半乳糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Mr=26 000)，一種是葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Mr=52 000)。epsE下游的基因編碼了糖基轉(zhuǎn)移酶以及一些未知功能的酶，參與了EPS聚合及輸出，糖的生物合成過程。一些學(xué)者認(rèn)為，eps基因簇3＇端可以通過orf14.9來鑒定，但是，一些菌株(如 Sfi6、MR-1C等)eps基因簇3＇端orf14.9下游仍存在編碼序列，或編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或編碼與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白［16－17］。

圖4 4 種不同的嗜熱鏈球菌 E PS 基因簇［16，17－20］GTF，糖基轉(zhuǎn)移酶;MTr，跨膜運(yùn)輸;Pol，聚合反應(yīng);Reg，調(diào)控;SB，糖的生物合成;Unk，未知

目前針對(duì)LAB EPS的合成量低的問題，很多學(xué)者都致力于利用基因工程技術(shù)，通過對(duì)EPS合成途徑的基因調(diào)控，達(dá)到增加EPS產(chǎn)量的目的。在圖2中可以看出，從葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成葡萄糖-1-磷酸再形成UDP-葡萄糖是LAB EPS生物合成途徑中的關(guān)鍵限制性步驟，葡萄糖1-磷酸和UDP-葡萄糖的濃度水平?jīng)Q定著EPS合成量的高低。因此，可以通過過量地表達(dá)涉及限制性步驟的磷酸葡萄糖變位酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶或UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶?？梢允辜?xì)胞內(nèi)UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖大量積累，從而提高胞外多糖的產(chǎn)量［21］。對(duì)于某些乳酸菌如干酪乳桿菌，UDP-半乳糖對(duì)胞外多糖的形成也具有重要影響。但是在乳酸球菌中過量地表達(dá)UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶，可以使UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和 dTDP-鼠李糖的水平提高，但對(duì)EPS的產(chǎn)量影響不大［22］。因此可以看出，不同LAB菌株細(xì)胞內(nèi)激活糖的水平對(duì)EPS產(chǎn)量的影響是不同的。另一種提高EPS產(chǎn)量的方法是在生物合成過程中多糖聚合作用的水平上.通過提高參與EPS聚合作用的糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活性來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的提高。如在乳酸球菌中，過量地表達(dá)起始糖基轉(zhuǎn)移酶(priming glycosyltransferase)，可以使EPS產(chǎn)量得到一定程度的提高［23］。此外，通過克隆整個(gè)EPS基因簇，并在多拷貝數(shù)的單個(gè)質(zhì)粒中過量地表達(dá)也可以調(diào)控EPS的生物合成［24］。

在利用基因工程技術(shù)對(duì)LAB改造過程中，發(fā)現(xiàn)了EPS產(chǎn)量及其黏度在LAB表達(dá)過程中的存在不穩(wěn)定問題，這同樣表現(xiàn)出了改造LAB菌株基因水平上的不穩(wěn)定。如1株嗜熱鏈球菌在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，不同時(shí)間內(nèi)EPS產(chǎn)量和黏度分別在45～340 mg/L和41～240 mPa·s之間變動(dòng)［25］。在大多數(shù)LAB菌株中，這些顯性性狀是由通過質(zhì)粒DNA編碼的，而這種性狀的不穩(wěn)定甚至丟失可能是源于質(zhì)粒的丟失［17］。如所有嗜熱鏈球菌eps基因簇都位于染色體上，這種顯性性狀的不穩(wěn)定或者丟失可能是由于插入序列的位置位于或者接近eps基因簇，或者是一些菌株的eps基因本身就具有不穩(wěn)定性［19］。

4 結(jié)語

近十幾年來，生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，加速了LAB EPS的深入研究，LAB基因、化學(xué)結(jié)構(gòu)與功能特性之間的關(guān)系，及其表現(xiàn)出的功能特性的作用機(jī)理，等等，都將是今后研究的熱點(diǎn)。雖然目前存在著諸多問題，不少學(xué)者已經(jīng)試圖通過基因工程技術(shù)來提高EPS產(chǎn)量和定向改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，不過至今并沒有取得較大的進(jìn)展。隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步和層次不斷深入，在基因、分子水平上對(duì)LAB EPS的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的闡明將不斷明朗，從而可以定向構(gòu)建、生產(chǎn)出具有理想功能特性的LAB EPS。作為食品級(jí)微生物多糖的LAB EPS，必將在乳制品的生產(chǎn)，保健食品的開發(fā)及醫(yī)藥領(lǐng)域的創(chuàng)新等方面得到更加廣泛的應(yīng)用。

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Biosynthesis and Genetic Regulation of Exopolysaccharides

from Lactic Acid Bacteria

Yao Jing1，Ren Jing2，Wu Zheng-jun2，Wang Yin-yu2，Guo Ben-heng1，2

1(Food College of Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)2(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center of Bright Dairy Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China)

Exopolysaccharides is produced by Lactic acid bacteria which is General Recognized As Safe status(GRAS).As its excellent functions，it is becoming a research hotspot recently.However，its industrial application is limited by the low production level.Therefore，it is significant for studying the genetics to improve the production.This paper mainly concerns about the classification and structure of exopolysaccharides，biosynthesis of homopolysaccharides and heteropolysaccharides，besides the discrepancies between these two exopolysaccharides.Genetic regulation and some effective regulation measures are closely discussed as well.This paper should provide a theoretical reference for further research.

Lactic acid bacteria，exopolysaccharide，biosynthesis，genetic regulation

碩士研究生(郭本恒教授為通訊作者，E-mail:guobenheng@brightdairy.com)。

*“十一五”國家科技支撐計(jì)劃(2006BAD04A14，2006BAD04A06)。

2010－08－13，改回日期:2010－12－17