石 晶（綜述），孔曉慧（審校）

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院兒科研究所免疫室，北京 100045）

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）自從問世以來，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，其在各項(xiàng)領(lǐng)域中的作用已愈顯重要，特別是在各種病毒的快速準(zhǔn)確檢測中，更是以往的傳統(tǒng)檢測方法所不能比擬的。PCR的基本過程類似于DNA的天然復(fù)制，特異性依賴于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。整個過程由變性-退火-延伸3個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。通常，每完成一個循環(huán)需時(shí)2～4 min，2～3 h就能將靶核苷酸擴(kuò)增放大幾百萬倍［1］。目前的PCR技術(shù)已有十幾種，每種都有其優(yōu)缺點(diǎn)，下面對各種PCR技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用作簡要綜述。

1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcript PCR，RT-PCR）

RT-PCR是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的敏感度提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于:分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。采用敏感性較高的RT-PCR方法，總的病毒檢出率提高，且檢測的病毒種類比較多，對目前報(bào)道的可引起兒童呼吸道感染的9種常見病毒病原包括新發(fā)現(xiàn)的人類博卡病毒均能進(jìn)行檢測［2］。

2 PCR-免疫

在常規(guī)的分子生物學(xué)中，對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的分析主要是采用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察、拍照。這種方法簡單經(jīng)濟(jì)，但是其缺點(diǎn)是存在假陰性、假陽性，溴化乙錠污染環(huán)境，紫外線傷害人體，只能進(jìn)行定性或半定量分析，不能準(zhǔn)確定量［3］。目前發(fā)展的 PCR-免疫，即用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法來檢測并定量PCR產(chǎn)物已經(jīng)解決了這個問題。PCR-免疫技術(shù)包括被測目的DNA的PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物的檢測兩部分。它主要是用一對分別標(biāo)記了生物素和捕獲抗體固定擴(kuò)增產(chǎn)物，用標(biāo)記上堿性磷酸酶的抗地高辛抗體進(jìn)行雙抗夾心ELISA。與凝膠電泳、EB顯色相比，ELISA方法檢測定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果具有更高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。凝膠電泳、EB顯色的變異系數(shù)（CV）達(dá)到38%，而ELISA的變異系數(shù)只有10%。而且，以熒光染料AttoPhos作為顯色底物的ELISA檢測敏感度比凝膠電泳、EB顯色高10倍。另外，熒光強(qiáng)度和抗原檢測量的相關(guān)系數(shù)也高達(dá)99%。這種PCRELISA更節(jié)省時(shí)間，且易于自動化操作和便于臨床檢測。它也為病毒的早期檢測提供了一個可行的平臺，因?yàn)樗枰臉颖玖亢苄。?］。國際上免疫PCR技術(shù)近兩年發(fā)展很快，主要用于檢測體內(nèi)激素、腫瘤、病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體等［5］，它作為一種抗原檢測系統(tǒng)，同時(shí)具有抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR的高敏感性、適合于各種微量抗原的檢測，并且可以直接檢測細(xì)胞上的抗原。

3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

所謂實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)檢測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的一種方法。在傳統(tǒng)的PCR中，通常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的最終產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對PCR定量存在不足之處。在實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR中，對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測和連續(xù)的分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，監(jiān)測到的熒光信號變化可以匯成一條曲線，在PCR反應(yīng)的早期，產(chǎn)生的熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最后的平臺期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來檢測PCR產(chǎn)生的量，并且由此來推斷模板最初的量。實(shí)時(shí)熒光的應(yīng)用很廣泛，包括mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定等，它是一種常規(guī)的能分析病毒核苷酸特性的檢測方法［6］。張萍等［7］對617份流感病毒標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測陽性152份，陽性率為24.64%;犬腎傳代細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒79株，陽性率為12.80%。兩者的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和細(xì)胞培養(yǎng)方法檢測流感病毒具有一致的特異性。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR可作為一種快速有效的流感病毒核酸檢測法，適用于公共衛(wèi)生應(yīng)急疫情的實(shí)驗(yàn)室快速診斷。胡曉武等［8］以甲型流感病毒特異M基因的保守區(qū)為靶區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物和TaqMan熒光探針，建立一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，并對乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠狀病毒OC43及229E、副流感病毒（1、2、3型）以及季節(jié)性流感病毒（H1、H3）進(jìn)行檢測，得出一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR可對甲型流感病毒進(jìn)行特異擴(kuò)增，操作方便快速，對H1和H3亞型的最低檢出限可達(dá)0.01 TCID 50/mL;對384例臨床咽拭子樣本的檢測準(zhǔn)確度達(dá)99.5%，一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法可實(shí)現(xiàn)對甲型流感病毒快速準(zhǔn)確的檢測，有助于對臨床流感病例的快速診斷。與其他檢測技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感度分別是病毒分離培養(yǎng)的10倍，常規(guī) RT-PCR的30～40倍。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合使定量極微量的基因表達(dá)或DNA拷貝成為可能，但是與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR也有不足之處:①由于運(yùn)用了封閉的檢測，減少了擴(kuò)增后的電泳的檢測步驟，因此也就不能監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小;②實(shí)時(shí)熒光PCR因?yàn)闊晒夥N類及光源的局限性，相對地限制了多重檢測得能力;③目前此項(xiàng)技術(shù)的成本較高［9］。

4 多重PCR

多重PCR（multiplex PCR，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR），是在同一PCR反應(yīng)體系里加入兩對或兩對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。多重PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于核酸診斷的許多領(lǐng)域，包括基因剔除分析、突變和多態(tài)性分析、定量分析及RNA檢測等。在感染性疾病領(lǐng)域，多重PCR技術(shù)已經(jīng)顯示出它的價(jià)值，成為識別病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲的有效方法。一次多重PCR反應(yīng)可同時(shí)檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨(dú)特的優(yōu)勢和很高的實(shí)用價(jià)值［10］。當(dāng)前多重PCR在病原微生物的檢測方面應(yīng)用最為廣泛。雖然多重PCR檢測方法僅為定性檢測，但其發(fā)展較為成熟，在保持了較高特異性和敏感度的同時(shí)，研制周期和成本明顯低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和基因芯片，實(shí)驗(yàn)步驟簡單，檢測時(shí)間短，有利于在臨床廣泛應(yīng)用。

5 多重PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的反式線點(diǎn)雜交（multiplex PCR-based reverse line blot hybridization，mPCR/RLB）

北京兒童醫(yī)院［11］利用mPCR/RLB檢測7種病毒株，均得到相應(yīng)的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增條帶清晰，與目標(biāo)片段一致。且7種病毒株:人流感病毒（A、B型）、人副流感病毒（1、2、3 型）、人腺病毒（Adv）、呼吸道合胞病毒（RSV）RLB雜交均得到清晰的雜交模式，并且彼此之間沒有交叉反應(yīng)。與作為陽性對照的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株亦沒有交叉反應(yīng)。RLB方法的敏感度比PCR高10～100倍，任何一種毒株間均沒有交叉反應(yīng)，7種病毒株同時(shí)與作為陽性對照的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均沒有交叉反應(yīng)，顯示了特異的雜交模式。延長免疫印記底物曝光時(shí)間至過夜，同樣沒有交叉反應(yīng)。同一張膜重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果完全一致，雜交信號無減弱現(xiàn)象。mPCR/RLB是方便、客觀的檢測方法，它能同時(shí)從43個不同標(biāo)本中檢測到43個目標(biāo)基因，它的靈活性要比DNA微陣列高，并且還便宜［12］。mPCR/RLB所需 DNA 量少，儀器簡單，雜交膜可重復(fù)利用，每張膜可重復(fù)使用15～20次，大大降低了每份標(biāo)本的檢測費(fèi)用。同一份標(biāo)本可多次重復(fù)，雜交結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性好。本法具備了簡單、經(jīng)濟(jì)而且靈活等特點(diǎn)，適合混合感染和需要較高培養(yǎng)要求的病原體的檢測［13］，一次檢測標(biāo)本數(shù)可多達(dá)43份，適合對臨床標(biāo)本進(jìn)行高通量檢測。

6 多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的實(shí)質(zhì)是指在一個反應(yīng)管中加入針對多種基因的引物和不同標(biāo)志物標(biāo)記的探針（通常為可發(fā)出不同波長熒光的基團(tuán)），以對多重目標(biāo)基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。該方法在呼吸道疾病病原體的診斷中有廣闊的應(yīng)用前景［14］。多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)核酸擴(kuò)增和檢測在同一反應(yīng)密封管中同時(shí)進(jìn)行，具有敏感度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確快速的特點(diǎn)，但是其引物和探針設(shè)計(jì)較為困難，并且需要具備多通道檢測能力的實(shí)時(shí)熒光PCR儀。Chen等［15］用實(shí)時(shí)熒光技術(shù)在同一個檢測管里檢測新型HINI-2009病毒和季節(jié)性H3N2病毒、流感病毒B和呼吸道合胞病毒，其檢測靈敏度和特異度分別為99%和100%。Hymas等［16］用三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測流感病毒A、流感病毒B和呼吸道合胞病毒，與疾病控制中心的結(jié)果對比，流感病毒A的檢出率是100%，此技術(shù)有99%的符合率。對流感病毒的檢出限制在750～1500個拷貝之間，并且與其他呼吸道病之間沒有交叉反應(yīng)。多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與病毒培養(yǎng)或免疫熒光相比有96.5%的特異性和98.0%的靈敏度［17］。當(dāng)冬季流感病毒和呼吸道合胞病毒一起傳播的時(shí)候，這種方法對病毒的同時(shí)檢測很有用［18］。但是，該方法在臨床診斷中最大的障礙是:如何能保證在同一反應(yīng)體系中，針對每一病原體的PCR的特異性和敏感性都能達(dá)到臨床的檢測要求。

7 反轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)（multi-locus RT-PCR followed by electrospray ionization mass spectrometry，RT-PCR/ESⅠ-MS）

RT-PCR/ESI-MS結(jié)合了反轉(zhuǎn)錄和質(zhì)譜分析的優(yōu)點(diǎn)，它是一種高通量的核酸依賴技術(shù)，能精確地測出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量。這種技術(shù)首先用于微生物的鑒定和確定分型，后來又應(yīng)用于流感病毒的檢測和鑒定［19］，它使呼吸道病毒的快速診斷成為可能［20］。檢測呼吸道病毒的RT-PCR/ESI-MS能一次性檢測出呼吸道合胞病毒，如流感病毒A、B，1～4型的副流感病毒、腺病毒、冠狀病毒和人偏肺病毒等多種病毒。Chen等［21］通過對2007～2008年呼吸急診室中的患者檢測發(fā)現(xiàn)，RT-PCR/ESI-MS的靈敏度和特異度分別是89.1%和80.3%，在傳統(tǒng)檢測方法中不能被檢測到的病毒也被檢測到。此種技術(shù)的功能在呼吸道病毒的檢測中是明確的。

8 環(huán)介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP是近年來發(fā)展出來的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)。通過設(shè)計(jì)識別目的片段6個序列的4個特異引物，整個反應(yīng)可以在恒溫（60～65℃）條件下1 h內(nèi)完成，由于采用4個引物，與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，LAMP簡化了94℃變性的步驟，同時(shí)退火和延伸在同一溫度條件下進(jìn)行，整個擴(kuò)增反應(yīng)歷時(shí)短，一般為30～60 min即可判斷結(jié)果。Le等［22］結(jié)合RNA的快速提取和RT-LAMP，9種目的病毒都能在2 h之內(nèi)檢測到，這種檢測技術(shù)的敏感性比一步RT-PCR要高或與之相同，并且，有兩種病毒不光在感染的病例中被檢測到，在昆蟲的攜帶者中也有檢測到。它具有敏感、特異的特點(diǎn);且產(chǎn)物中有大量的副產(chǎn)物——白色焦磷酸鎂沉淀，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過肉眼觀察或濁度計(jì)即可判定結(jié)果;反應(yīng)不需要精密控溫設(shè)備和高級復(fù)雜的分析儀器，對操作人員的熟練度和專業(yè)水平要求不高，因此該方法特別適合基層或者實(shí)驗(yàn)條件較差的試驗(yàn)室進(jìn)行病原微生物的快速檢測［23］。

9 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）

AFLP技術(shù)是一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)，是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。限制性片段用兩種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，另一種是常用切割酶。它結(jié)合了限制性片段長度多態(tài)性和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的DNA多態(tài)性可作為一種分子標(biāo)記。AFLP具有可靠性好，重復(fù)性強(qiáng)，可信度高等優(yōu)點(diǎn)。de Vries等［24］通過調(diào)整反轉(zhuǎn)錄酶和降低rRNA的復(fù)制優(yōu)化了AFLP技術(shù)，使其明顯地增強(qiáng)了反應(yīng)的敏感性，也提供了一種可行的直接從患者的物體上檢測到病毒的方法。

呼吸道病毒是一組能夠通過呼吸道傳播引起呼吸系統(tǒng)或及其他系統(tǒng)疾病的病原微生物。呼吸道病毒傳染性強(qiáng)，可以引起局部暴發(fā)和世界大范圍流行，嚴(yán)重影響人類健康。由于呼吸道致病微生物感染臨床癥狀相似，影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，因此病原學(xué)證據(jù)在臨床診斷和流行病監(jiān)控中十分重要，由于傳統(tǒng)病毒診斷技術(shù)存在明顯缺陷，其在臨床中的應(yīng)用受限。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，特別是PCR技術(shù)的發(fā)展為呼吸道病毒的鑒定與分型提供了新的選擇。PCR反應(yīng)中根據(jù)病毒保守序列設(shè)計(jì)引物，并可對微量模板（pg水平）進(jìn)行指數(shù)級擴(kuò)增，是簡便、快速、敏感、特異性強(qiáng)的病毒檢測方法。正如有人提到的，最初PCR的出現(xiàn)，并不是為了解決某一個特定的難題，PCR出現(xiàn)后，各種各樣的需要PCR方法才能解決的問題，就不斷出現(xiàn)。

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