周蓉，尹軍華，翁榕安，陳作紅

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó)長(zhǎng)沙 410081）

黑柄炭角菌水溶性多糖XNW-1的分離純化與結(jié)構(gòu)分析

周蓉，尹軍華，翁榕安，陳作紅*

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó)長(zhǎng)沙 410081）

黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲經(jīng)熱水浸提、Sevag法脫蛋白、透析、乙醇沉淀、DEAE－52纖維素層析和Sephadex G－100凝膠層析等分離純化，得到黑柄炭角菌多糖組分XNW－1，紫外掃描檢測(cè)和Sephadex G－100分析表明XNW－1為均一組分，相對(duì)分子質(zhì)量9.0×105.單糖組成分析表明XNW－1只含葡萄糖.XNW－1的糖含量為96%.紅外光譜、GC－MS、1H和13C核磁共振結(jié)構(gòu)分析表明:XNW－1由α型糖苷鍵構(gòu)成，（1→4）葡萄糖（82%）的連接方式，構(gòu)成主鏈的核心;其他連接方式包括（1→4，6）葡萄糖（12%），（1→6）葡萄糖（1%），末端（1→）連接葡萄糖（5%）;末端糖基所占比重不大，說(shuō)明XNW－1為低分支結(jié)構(gòu).

黑柄炭角菌;多糖;分離純化;結(jié)構(gòu)分析

黑柄炭角菌［Xylaria nigripes（Klotzsch）Sacc.］是子囊菌亞門(mén)（Ascomycotina），炭角菌科（Xylariaceae）的一種名貴藥用真菌，別名烏靈參.具有除濕、鎮(zhèn)靜安神、造血以及提高機(jī)體免疫功能等功效［1］.有關(guān)黑柄炭角菌的藥理報(bào)道較多并已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用［2－4］，但對(duì)于黑柄炭角菌中的有效活性成分研究不多，陳宛如等對(duì)其基本的氨基酸、腺苷、多糖、維生素等組成成分進(jìn)行了初步分析［5］;廖瓊等對(duì)黑柄炭角菌不同組織的核苷成分進(jìn)行了HPLC測(cè)定［6］;吳根福從黑柄炭角菌深層發(fā)酵制品中獲得了具有DPPH自由基捕捉活性成分，推斷它為5，8二羥基3甲基3，4二氫異香豆素［7］;龔慶芳等從黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲中分離得到9個(gè)化合物，其中化合物1－（2，6－二羥基苯）－3－羥基－丁酮具有很強(qiáng)的清除自由基能力和還原力［8－9］.關(guān)于黑柄炭角菌多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)分析目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.本文選取黑柄炭角菌菌絲體水溶性多糖為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)特征分析，為進(jìn)一步研究其藥理作用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

黑柄炭角菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)條件參照朱志雄等［10］的方法，由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌研究室提供;DEAE－52纖維素柱、Sephadex G－100和Sepharose CL－6B均為瑞典Pharmaci公司;各種標(biāo)準(zhǔn)單糖、糖醇、TMS均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;其他試劑均為分析純.

1．2 儀器與設(shè)備

WD－9403C紫外分析儀、752紫外光柵分光光度計(jì)，上海精密儀器有限公司;透析袋（截流范圍8 000～15 000）Green Bird公司;R－200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞典BUCHI公司;Lambda Bio40紫外光譜儀，Avatar 370 FT－IR紅外光譜儀，美國(guó)Thermo公司，BrukerAMX－400和DRX－500 MHz核磁共振波譜儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）美國(guó)，Varian 3400氣相色譜儀（附FID檢測(cè)器），美國(guó);色（氣）質(zhì)聯(lián)機(jī)HP5890（Ⅱ）GC/HP5988MS，美國(guó)安捷倫公司.

1．3 方法

1.3.1 多糖的提取與純化發(fā)酵菌粉粉碎→95%乙醇脫脂6 h→95～100℃水浴加熱浸提3 h→重復(fù)浸提2次，合并濾液→減壓濃縮→乙醇沉淀（95%，3倍體積）→離心分離（5 000 r/min，8 min）→沉淀用無(wú)水乙醇洗滌2次→真空冷凍干燥得水溶性粗多糖XNW→Sevag法脫蛋白→上清液流水透析3 d→加95%乙醇至糖液濃度為30%→沉淀離心→真空冷凍干燥得脫蛋白多糖XNW→DEAE－52纖維素柱層析（洗脫液分別用蒸餾水、0.1 mol/L NaCl分段梯度洗脫，柱規(guī)格為20 mm×500 mm，每管收集6 mL）→苯酚－硫酸法逐管檢測(cè)多糖含量→分別合并主糖峰，濃縮凍干，依次得2個(gè)多糖組分XNW－1和XNW－2→XNW－1進(jìn)一步進(jìn)行Sephadex G－100（1.5 cm×70 cm）柱層析色譜（蒸餾水洗脫，收集條件為每管收集約5 mL/10 min）→苯酚－硫酸法逐管檢測(cè)多糖含量→收集洗脫峰部位的洗脫液，合并濃縮凍干→純化的多糖XNW－1.

1.3.2 多糖的純度檢測(cè)和含量測(cè)定紫外掃描檢測(cè)將收集得到的多糖XNW－1取少量溶解，采用紫外光譜儀在200～400 nm之間掃描，觀察260 nm、280 nm處是否有吸收峰.

苯酚－硫酸法測(cè)定XNW－1的吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線求XNW－1的糖含量.

1.3.3 多糖的理化性質(zhì)分析真空干燥XNW－1粉末呈白色，各取適量分別溶于冷水、熱水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等溶劑檢測(cè)溶解度.XNW－1加碘液反應(yīng)，檢測(cè)是否為淀粉性葡聚糖.

1.3.4 多糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定［11］采用凝膠柱層析法，樣品XNW－1和Dextran系列經(jīng)Sepharose CL－6B洗脫后，根據(jù)洗脫峰的形狀判斷樣品XNW－1的純度，以Dextran系列標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)與洗脫體積作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)峰值管洗脫體積查標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品XNW－1相對(duì)分子質(zhì)量洗脫體積求得的相對(duì)分子質(zhì)量.

1.3.5 單糖組成分析取純化后的多糖組分5 mg，倒入具塞試管，加2 mL 1 mol/L的三氟乙酸，封管于120℃水解2 h，減壓蒸干，溶于水，進(jìn)行樣品XNW－1及標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄糖、果糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖）硅膠薄層色譜分析，由斑點(diǎn)確定樣品的單糖組成.

1.3.6 甲基化反應(yīng)［12－13］稱(chēng)取20 mg徹底干燥糖樣X(jué)NW－1，溶于6 mL二甲亞砜（DMSO，以4?分子篩脫水），充N(xiāo)2封管后，40℃磁力攪拌至糖樣充分溶解（15 h）.加入6 mL NaOH－DMSO混懸液（將240 mg 0.178 mm過(guò)篩的NaOH（70℃真空干燥）與6 mL DMSO在勻漿器中混合，充N(xiāo)2密封，25℃磁力攪拌，使其成為均勻的混懸液）和3.6 mL碘甲烷，密封，磁力攪拌7 min后加入6 mL蒸餾水以終止反應(yīng).將其裝入透析袋內(nèi)，用流水和蒸餾水各透析24 h，以氯仿萃取3次，合并氯仿層，用蒸餾水洗3次，無(wú)水Na2SO4干燥24 h，過(guò)濾，蒸除氯仿至1 mL左右，用紅外光譜儀檢查在3 400 cm－1處無(wú)—OH吸收峰.向甲基化多糖中加入85%甲酸1 mL后充N(xiāo)2封管，100℃水解4 h，無(wú)水乙醇驅(qū)酸后真空干燥，再加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，100℃水解6 h，再用無(wú)水乙醇驅(qū)酸后，加入NaBH4還原，乙?；稍?，用少量氯仿溶解后進(jìn)行GC－MS分析.

1.3.7 NMR分析核磁共振的1H－NMR譜是用BrukerAMX－400核磁共振儀測(cè)定（TMS為內(nèi)標(biāo)，D2O為溶劑）;13C－NMR譜是用DRX－500 MHZ測(cè)定（DSS為內(nèi)標(biāo)，D2O為溶劑）.

1.3.8 多糖的糖鏈中糖苷鍵及糖環(huán)構(gòu)型確定紅外光譜分析:取10 mg干燥的XNW－1進(jìn)行溴化鉀（KBr）壓片，在傅立葉紅外光譜儀中測(cè)定IR圖，掃描波長(zhǎng)為4 000～400 cm－1.

2 結(jié)果與分析

2．1 XNW-1分離純化及基本理化性質(zhì)

黑柄炭角菌粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白、透析、乙醇沉淀、DEAE－52纖維素柱層析及Sephadex G－100凝膠柱色譜分離純化得到均一多糖XNW－1（圖1）.XNW－1呈白色粉末狀，無(wú)氣味，較難溶于冷水，易溶于熱水，其水溶液濃度大時(shí)呈透明膠稠狀，易被醇、酮等有機(jī)溶劑析出.XNW－1遇碘液不變色，說(shuō)明為非淀粉性多糖;平均相對(duì)分子質(zhì)量為9×105.

XNW－1的紫外掃描結(jié)果（圖2）表明，只有在200 nm左右顯示多糖吸收峰，無(wú)260 nm處的核酸吸收峰和280 nm處的蛋白質(zhì)吸收峰.說(shuō)明純化所得的XNW－1不含核酸和蛋白質(zhì).經(jīng)苯酚－硫酸法測(cè)定XNW－1的糖含量為96%.

圖1 XNW－1的Sephadex G－100柱色譜圖

圖2 XNW－1的紫外光譜檢測(cè)

2．2 XNW-1的單糖組成分析

經(jīng)過(guò)完全酸水解和薄層層析（見(jiàn)圖3）可以看到各種單糖在苯胺－二苯胺試劑的顯色作用下呈色情況分別為葡萄糖:暗藍(lán)灰色，果糖:紫灰色，鼠李糖:棕褐色，半乳糖:灰色，阿拉伯糖:棕綠色，木糖:棕綠色.XNW－1只有單一暗藍(lán)灰色斑點(diǎn)，說(shuō)明只含葡萄糖.

圖3 多糖XNW－1酸水解薄層層析圖

2．3 紅外光譜分析

XNW－1紅外光譜分析（圖4）表現(xiàn)出一般多糖類(lèi)物質(zhì)的特征吸收峰:XNW－1的849 cm－1為α構(gòu)型吡喃糖才具有，3 408 cm－1處的寬峰為—OH伸縮振動(dòng)峰，2 927 cm－1處為C—H，1 648 cm－1左右有C—O非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，1 200 cm－1～1 000 cm－1處有3個(gè)吸收峰，為C—O—H和C—O—C的吸收峰，證明是吡喃糖.

圖4 XNW－1的紅外光譜圖

2．4 甲基化分析

XNW－1經(jīng)甲基化、水解、還原、乙?；蟮玫讲糠旨谆奶谴家宜狨?，進(jìn)行GC/MS色質(zhì)聯(lián)機(jī)分析后，通過(guò)對(duì)照質(zhì)譜譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，得到甲基化分析結(jié)果（圖5～6），分析列于表1和表2.

圖5 甲基化XNW－1氣相分析

圖6 甲基化XNW－1氣質(zhì)聯(lián)用分析

表1 XNW－1甲基化產(chǎn)物分析

表2 XNW－1單糖摩爾比和糖苷鍵

由表1和表2可知:XNW－1中主要連接方式為1→4連接葡萄糖，所占比例為82%，其他連接方式1→6連接葡萄糖占12%，1→4，6連接葡萄糖占1%，末端1→連接葡萄糖占5%.末端葡萄糖占總糖基量的1/20，有一定比例，說(shuō)明多糖XNW－1具有一定的分支結(jié)構(gòu).

2．5 NMR分析

XNW－1的1H－NMR和13C－NMR譜圖如圖7和圖8，根據(jù)圖7可知，XNW－1的C－1質(zhì)子的δ值都超過(guò)5.0×10－6，都為α型吡喃己糖.從圖8可以看出:C－1的信號(hào)有101.851×10－6和99.879×10－6，表明多糖的異頭碳的構(gòu)型僅為α－構(gòu)型，且分別指α－Glc（1→4），α－Glc（1→6）;C－4的取代位移信號(hào)有81.133×10－6和80.458×10－6，分別指Glc（1→4，6）和Glc（1→4）;69.418×10－6表示C－6有被取代的，而60.613×10－6和60.296×10－6則是未被取代的C－6的信號(hào).

圖7 XNW－1氫譜圖

圖8 XNW－1碳譜圖

3 結(jié)論

以黑柄炭角菌菌絲體為原料，分離純化后得水溶性多糖XNW－1.XNW－1呈白色粉末狀，含糖量96%，平均相對(duì)分子質(zhì)量9.0×105.XNW－1經(jīng)水解、薄板層析，紅外光譜和核磁共振分析確定其由葡萄糖組成，糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型，主要由α型糖苷鍵構(gòu)成，（1→4）葡萄糖（82%）的連接方式，構(gòu)成主鏈的核心;其他連接方式包括（1→4，6）葡萄糖（12%），（1→6）葡萄糖（1%），末端（1→）連接葡萄糖（5%）;末端糖基所占比重不大，說(shuō)明XNW－1為低分支結(jié)構(gòu).

［1］徐錦堂.中國(guó)藥用真菌學(xué)［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997.

［2］馬志章，張曙云，陳宛如，等.黑柄炭角菌多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響［J］.免疫學(xué)雜志，1989（2）:13－16.

［3］馬志章，左萍萍，陳宛如，等.烏靈菌粉的鎮(zhèn)靜作用及其機(jī)理研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1999（6）:375－376.

［4］許瑞珠，馬志章，陳宛如.烏靈參膠囊治療前列腺增生癥臨床觀察［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，1994（2）:11－12.

［5］陳宛如，方鴻峰，馬志章.真菌中藥烏靈參化學(xué)成分的初步研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1990，25（11）:647－649.

［6］廖瓊，周蓉，陳作紅.黑柄炭角菌不同組織的核苷成分HPLC測(cè)定［J］.食品科學(xué)，2009，30（16）:228－230.

［7］吳根福.黑柄炭角菌產(chǎn)生的DPPH自由基捕捉成分［J］.微生物學(xué)報(bào)，2001，41（3）:363－366.

［8］龔慶芳，張玉梅，譚寧華，等.黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲體的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33（11）:1269－1271.

［9］龔慶芳，武守華，譚寧華，等.黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲中抗氧化及抗腫瘤活性的有效成分研究［J］.食品科技，2008，33（12）: 28－31.

［10］朱志雄，張澤文，張平，等.黑柄炭角菌的菌種分離及其培養(yǎng)特性［J］.中國(guó)食用菌，2005，24（5）:15－18.

［11］王昭晶，梁忠?guī)r，羅巔輝，等.小刺猴頭菌水溶性多糖HPⅡ的結(jié)構(gòu)研究［J］.分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21（4）:28－31.

［12］CIUCANU I，KEREK F.A simple and rapid method for permethylation of carbohydrate［J］.Carbohydr Res，1984，131:209－217.

［13］史軍花，梁忠?guī)r，耿慧，等.猴頭菌發(fā)酵菌絲水溶性多糖HPA的結(jié)構(gòu)確定［J］.分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19（2）:123－126.

Isolation，Purification and Structure Analysis of Water-Soluble Polysaccharides of Xylaria Nigripes

ZHOU Rong，YIN Jun-hua，WENG Rong-an，CHEN Zuo-hong*
（College of Life Science，Hunan Normal University，Changsha 410081，China）

The polysaccharide XNW－1 was isolated from the fermented mycelium of Xylaria nigripes （Klotzsch）Sacc.through hot－water extraction and subjected to Sevag deprotein，dialysis，ethanol precipitation，DEAE－52 cellulose ion－exchange column chromatography and Sephadex G－100 column chromatography.This polysaccharide was found to be highly homogeneous with a relative molecular mass of 9.0×105.Analysis of monosaccharide composition revealed XNW－1 were only made up of glucose.The total sugar content of XNW－1were 96%. The chemical structure of XNW－1 was analyzed by IR，GC－MS，1H－NMR，and13C－NMR.These results indicated that XNW－1 has the following structure:XNW－1 is mainly made up of α configuration glycosidic，its basic structure was composed of major（1→4）linked glucose（82%），other linkages including（1→4，6）glucose（12%），（1→6） glucose（1%）and terminal（1→）glucose（5%）.XNW－1 was a kind of lowly branched structure.

Xylaria nigripes;polysaccharide;isolation and purification;structural analysis

S567;R284

A

1000－2537（2011）05－0075－05

2011－04－22

湖南省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目（08A044）

*通訊作者，E－mail:chenzuohong@263.net

（編輯王?。?/p>