何光志，田維毅，高 英，王 平，王文佳，王乾宇，黃 高，安傳偉

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，中國(guó)貴陽(yáng) 550002;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，中國(guó)遵義 563003)

抗結(jié)核桿菌人源噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建及篩選

何光志1*，田維毅1，高 英2，王 平1，王文佳1，王乾宇1，黃 高2，安傳偉1

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，中國(guó)貴陽(yáng) 550002;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，中國(guó)遵義 563003)

目的:構(gòu)建人源噬菌體展示單鏈抗體(ScFv)庫(kù)，篩選抗結(jié)核桿菌特異性、高親和力的ScFv.方法:從結(jié)核患者的外周血淋巴細(xì)胞中，提取RNA并通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出VH和VL基因，并采用SOE-PCR構(gòu)建ScFv基因，將其克隆入噬粒載pCANTAB5E中，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌TG1，通過(guò)輔助噬菌體M13K07援救構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫(kù).結(jié)果:初級(jí)庫(kù)庫(kù)容量為3.5×106，在大腸桿菌TG1中重組后得到2.6×106的次級(jí)抗體庫(kù).結(jié)論:成功構(gòu)建噬菌體展示ScFv庫(kù)并獲得人源抗結(jié)核桿菌特異性ScFv，為進(jìn)一步研制抗抗結(jié)核桿菌的高特異性、高親和力的基因工程抗體奠定了基礎(chǔ).

結(jié)核桿菌;人源噬菌體單鏈抗體;制備及篩選

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)是引起結(jié)核病的病原菌，也稱(chēng)結(jié)核桿菌.可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見(jiàn).目前全球約有20億肺結(jié)核帶菌者，現(xiàn)癥結(jié)核患者2 000萬(wàn)，每年有1 000萬(wàn)人新發(fā)病和300萬(wàn)人死亡.我國(guó)結(jié)核患者人數(shù)居世界第二位，全國(guó)1/3的人口曾受到結(jié)核菌的感染［1］.

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是抗體工程領(lǐng)域的最重要進(jìn)展，各種小分子抗體相繼產(chǎn)生，在疾病的診斷與防治、自身免疫性疾病與病毒性疾病的鑒別研究、腫瘤的影像分析和導(dǎo)向治療或基因治療等多個(gè)領(lǐng)域有著潛在的優(yōu)勢(shì).該技術(shù)具有簡(jiǎn)單易行、生產(chǎn)成本低、篩選容量大等優(yōu)點(diǎn)［2］.本研究嘗試?yán)檬删w展示技術(shù)構(gòu)建大容量天然人源性噬菌體抗體庫(kù)，從中篩選出結(jié)核桿菌的人源性單鏈抗體(single chain Fv fragment，scFv)，為進(jìn)一步研制抗結(jié)核桿菌的特異性的基因工程抗體奠定了基礎(chǔ).

1 試劑

100 mL外周血來(lái)自10例康復(fù)1月的結(jié)核患者(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供)，淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自上海華精生物高科技有限公司.總RNA抽提試劑盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，GIBCOBRL 公司產(chǎn)品;DNA Purification System，Promega，公司產(chǎn)品;100 bp DNA Ladder，SfiⅠ和NotⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶，購(gòu)自大連寶生物公司;噬菌粒載體pCANTAB-5E、輔助噬菌體M13K07、大腸桿菌E.coliTG1、HRP/抗M13單克隆抗體，Amersham公司產(chǎn)品;結(jié)核桿菌抗原(批號(hào):984010)，購(gòu)自上海晶瑩生物制品公司.

2 方法

2.1 人源抗體VH和VL基因的PCR擴(kuò)增

以合成的cDNA為模板，VHf和VHr引物等物質(zhì)的量混合擴(kuò)增VH基因，Vκf/Vκr和Vλf/Vλr不同引物等物質(zhì)的量混合液擴(kuò)增VL基因.VL的PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min;94℃ 60 s，66℃ 30 s，72℃30 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min.VH的退火溫度為65℃，其他反應(yīng)條件同VL.PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的基因片段.

2.2 ScFv基因的構(gòu)建

通過(guò)重疊延伸拼接法將VH和VL基因拼接成ScFv基因.取純化的VH和VL基因片段經(jīng)94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，10個(gè)循環(huán)后，加含有酶切位點(diǎn)的引物VHf(SfiⅠ)和VLr(NotⅠ)，94℃ 30 s，66℃45 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán).PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收.

2.3 噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物ScFv純化回收，用SfiⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pCANTAB5E用T4 DNA連接酶，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，鋪SOBAG平板.用2×YTAG培養(yǎng)基洗脫菌落，稀釋至A600=0.5，加入輔助噬菌體M13K07繼續(xù)振搖1 h，離心后用2×YTAK培養(yǎng)基重懸后振搖過(guò)夜，次日離心收集上清，加入1/5體積的PEG/NaCl溶液，冰浴，離心，重懸沉淀即為噬菌體ScFv庫(kù)，過(guò)濾后于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?

2.4 抗體庫(kù)的重組率測(cè)定、酶切鑒定和多樣性分析

取適量抗體庫(kù)接種在20 mL 2×YT-ATK(含10 g/L Glucose，100 mg/L Amp及20 mg/L Tet)培養(yǎng)基中，37℃，振搖培養(yǎng)至A600=0.68，加入輔助噬菌體M13K07于37℃靜置60 min;4℃，3 500×g離心15 min，沉淀重懸于20 mL 2×YT-ATK(含100 mg/L Amp，20 mg/L Tet，70 mg/L Kan)中培養(yǎng)過(guò)夜;在4℃條件下，8 000×g離心15 min，上清用40 g/L PEG-8000和30 g/L NaCl沉淀，4℃，10 000×g離心30 min棄上清，離心管倒置除去PEG液;沉淀用適量的PBS重懸，移入另一離心管，反復(fù)吹打混勻，10 000×g離心5 min，上清即為噬菌體抗體庫(kù)，檢測(cè)庫(kù)容.用SB培養(yǎng)液將所制備的噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)謩e加入100 μL大腸桿菌TG1(A600=1)，室溫下感染20 min，涂SOBAG平板(含100 mg/L Amp)，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日計(jì)數(shù)噬菌落形成個(gè)數(shù)，計(jì)算噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容，4℃保存.

從SOBAG平板上隨機(jī)挑取15個(gè)單菌落，進(jìn)行PCR擴(kuò)增用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ScFv的重組情況;提取PCR鑒定為陽(yáng)性單菌落的質(zhì)粒，用SfiⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析酶切圖譜;隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆，采用PCR擴(kuò)增ScFv基因片段，電泳回收后，用BstNⅠ酶切，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析酶切圖譜.

2.5 噬菌體抗體庫(kù)的篩選

用包被液稀釋結(jié)核桿菌抗原1 μg/mL包被96孔ELISA板，100 μL/孔，含30 g/L BSA的PBS封閉，PBS洗滌后，加入噬菌體抗體庫(kù)100 μL，37℃溫育2 h;吸去噬菌體抗體液，以PBST洗滌1次(第2輪洗滌5次，第3～5輪洗滌10次)，PBST洗滌1次，加入100 μL洗脫液［含0.1 mol/L HCl(pH2)和1 g/L BSA］，于室溫靜置10 min;將洗脫液稍加吹打后吸出，立即用6 μL 2 mol/L Tris中和，加入2 mL大腸桿菌E.coliTG1，37℃靜置20 min，加入20 mL SB(含氨芐西林和四環(huán)素)，37℃培養(yǎng)2 h;加入M13K07、卡那霉素.進(jìn)行5次反復(fù)淘洗，收集沉淀.特異性噬菌體抗體得到高度富集.

2.6 ScFv的特異性鑒定

將第5輪篩選后洗脫的噬菌體感染大腸桿菌TG1，涂于SOBAG平板，過(guò)夜培養(yǎng)后，隨機(jī)挑選細(xì)菌菌落接種于4 mL含Amp和四環(huán)素的SOBAG培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取200 μL，加至4 mL含相同抗生素的SOBAG中，37℃振蕩培養(yǎng)2 h后加入40 μL M13K07，培養(yǎng)2 h;再加入Kan至70 mg/L，30℃振蕩培養(yǎng)12～16 h離心收集上清，即為單克隆噬菌體抗體，4℃保存.將待檢噬菌體抗體與等量10 g/L BSA混合，室溫孵育20 min，加至經(jīng)抗結(jié)核抗原包被和BSA封閉的ELISA板中，于37℃溫育2 h，用PBST洗板4次，PBS洗滌2次后，以HRP標(biāo)記的M13噬菌體單克隆抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，TMB顯色.

3 結(jié)果

3.1 抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增

以提取出的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增抗體基因重鏈和輕鏈可變區(qū).產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別在300～400 bp間出現(xiàn)條帶，結(jié)果見(jiàn)圖1.

3.2 單鏈抗體可變區(qū)片段(ScFv)的組裝和全長(zhǎng)擴(kuò)增

采用SOE-PCR的方法將抗體輕、重鏈可變區(qū)基因組裝成ScFv片段，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)，組裝后的ScFv基因在700～800 bp間出現(xiàn)條帶 (圖2).

圖1 VH和VL基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

圖2 ScFv基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

3.3 抗體庫(kù)的庫(kù)容、重組率測(cè)定及酶切鑒定

構(gòu)建的初級(jí)抗體庫(kù)經(jīng)(庫(kù)容=涂板后生長(zhǎng)出的噬菌斑數(shù)數(shù)目/涂板菌液量/涂板菌液稀釋的倍數(shù))計(jì)算，初級(jí)庫(kù)容量為3.5×106.隨機(jī)挑取20個(gè)菌落，經(jīng)PCR鑒定表明，重組率為80%，故次級(jí)庫(kù)的庫(kù)容量為2.6×106;陽(yáng)性質(zhì)粒做雙酶切鑒定，電泳示在700～800 bp間出現(xiàn)條帶(圖3).

3.4 抗體庫(kù)的多樣性

隨機(jī)挑取的10個(gè)單克隆，經(jīng)PCR擴(kuò)增ScFv基因片段，電泳回收后，以BstNⅠ酶切，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，抗體庫(kù)中抗體分子的多樣性良好，見(jiàn)圖4.

圖3 重組質(zhì)粒pCANTAB5E–ScFv雙酶切鑒定

圖4 單克隆的BstNⅠ酶切圖譜

3.5 噬菌體抗體庫(kù)的篩選

將抗結(jié)核桿菌抗原噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行5輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選.可以看到隨著洗滌次數(shù)的增加，噬菌體抗體的收獲率增加，經(jīng)過(guò)5輪篩選增加約110倍，表明噬菌體抗體庫(kù)得到富集(見(jiàn)表1).

表1 結(jié)核桿菌抗原對(duì)噬菌體抗體的富集

3.6 噬菌體ScFv特異性的初步鑒定

從第5輪篩選得到的菌落中隨機(jī)挑選20個(gè)克隆，制備噬菌體抗體，經(jīng)ELISA檢測(cè)，陽(yáng)性克隆孔中液體顯色，陰性孔中液體不變色.顯色后，陰性對(duì)照孔450 nm時(shí)A值為0.076，15株ELISA的A值較高，呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，其450 nm時(shí)A值分布于0.256～0.532之間，陽(yáng)性克隆檢出率約為75%.對(duì)其中12號(hào)陽(yáng)性克隆的可變區(qū)DNA序列和氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果該克隆重鏈可變區(qū)與GenBank中登錄的免疫球蛋白IgG重鏈可變區(qū)VH3有92%同源性，κ可變區(qū)與V-J4有92%同源性.表明12號(hào)陽(yáng)性克隆為抗結(jié)核桿菌抗原噬菌體抗體.

4 討論

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是采用PCR的方法將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來(lái)，與噬菌體包膜蛋白融合表達(dá)，從而展示于噬菌體表面，即可建成噬菌體抗體庫(kù).ScFv的基本結(jié)構(gòu)為VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，由于ScFv抗體分子量只有全抗體的1/6，抗體只有可變區(qū)片段，不含恒定區(qū)，免疫原性較低，故易于穿過(guò)血管壁和組織屏障，沒(méi)有Fc段，所以減少了與組織的非特異性結(jié)合，同時(shí)保留了與抗原結(jié)合的特異性和親和性，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床、科研、工業(yè)和新藥設(shè)計(jì)等領(lǐng)域均具有誘人的應(yīng)用前景［4-6］.

ScFv抗體在感染性疾病的診斷與防治、自身免疫性疾病與病毒性疾病的鑒別研究、腫瘤的影像分析和導(dǎo)向治療或基因治療、新型藥物設(shè)計(jì)等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用［7-13］.目前，在多種噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建，并從其中篩選出多株具功能活性的小分子抗體，如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ和gpl20等單鏈抗體或Fab抗體［14-17］，有些已進(jìn)入了臨床I/II期試驗(yàn).人源抗體的問(wèn)世徹底解決了小分子抗體的人源化問(wèn)題，極大地推動(dòng)了人源抗體的研究及應(yīng)用［18-20］.

抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因由相對(duì)保守的骨架區(qū)和能夠根據(jù)不同抗原做出相應(yīng)變化的抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)組成，雖然抗體分子可變區(qū)有著數(shù)量巨大的多樣性，但其骨架區(qū)的序列和前導(dǎo)序列相對(duì)保守，所以抗體可變區(qū)PCR引物的設(shè)計(jì)應(yīng)可能考慮親本抗體可變區(qū)序列的完整性和真實(shí)性.庫(kù)容量大小影響抗體庫(kù)質(zhì)量的最主要因素，而基因的多樣性是決定庫(kù)容量大小，其直接決定了接下來(lái)篩選高親和力的單鏈抗體［21］.因?yàn)榱馨图?xì)胞含目的抗體基因的mRNA是高豐度，有利于所建文庫(kù)被篩選及克隆出高親和力的抗體，所以選用淋巴細(xì)胞建庫(kù)較好［3］.本研究擴(kuò)增設(shè)計(jì)可變區(qū)引物時(shí)引用路艷等的工作［3］，通過(guò)提取患者康復(fù)后的外周淋巴細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT-PCR分別擴(kuò)增出H鏈和L鏈可變區(qū)基因，將VH和VL片段隨機(jī)拼接成ScFv片段克隆至pCANTAB5E載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)TG1菌，經(jīng)輔助噬菌體M13K07拯救，獲得人源抗結(jié)核桿菌噬菌體展示單鏈抗體庫(kù)，本研究為結(jié)核病的預(yù)防、診斷、治療等研究奠定了基礎(chǔ).此研究為結(jié)核臨床防治研究奠定了基礎(chǔ).

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Construction and Screening of Human Single-chain Antibody Library of Anti-Mycobacterium Smegmatis

HE Guang-zhi1*，TIAN Wei-yi1，GAO Ying2，WANG Ping1，WANG Wen-jia1，WANG Qian-yu1，HUANG Gao2，AN Chuan-wei1
(1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China;2.Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China)

Aim:To construct a human phage-displayedsingle-chain Fvantibody(ScFv)library and screen specificScFvagainstMycobacterium Smegmatis.Methods:The total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes in patients withMycobacterium Smegmatis，first strand cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit and an oligo(dT)-18 primer.To human immunoglobulin H chain and L chain variable region of degenerate primers，cDNA first strand as a template，were amplified H chain and L chain variable region genes.SOE-PCR method to VH and VL fragments were assembled intoScFvfragments and then cloned into pCANTAB5EScFvvector and transformed into competent TG 1 electric bacteria by helper phage rescue M13K07 getMycobacterium Smegmatissingle chain antibody phage display library.Results:A primary library of 3.5×106and a second library of 2.6×106were constructed.Conclusion:The results lay a solid foundation for preparation of human engineering antibody toMycobacterium Smegmatisreported herein with higher affinity.

Mycobacterium Smegmatis;human single-chain antibody;construction and screening

R378.91+1

A

1000-2537(2011)05-0070-05

2011-04-26

貴州省2011年社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(黔科合SY字(2011)3020)

*

，E-mail:heguangzhi7711@sina.com

(編輯 王 健)