孔丹鳳，趙 雯，盧婷利，惠倩倩，王韻晴，陳 濤,2

(1.空間生物實驗?zāi)M技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室，西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，陜西 西安 710072；2.陜西脂質(zhì)體工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710075)

·綜述·

分子印跡技術(shù)在藥物分離中的研究進展

孔丹鳳1，趙 雯1，盧婷利1，惠倩倩1，王韻晴1，陳 濤1,2

(1.空間生物實驗?zāi)M技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室，西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，陜西 西安 710072；2.陜西脂質(zhì)體工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710075)

分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer,MIPS)由于對分子具有特異性識別功能在近年來受到了各界科學(xué)家的廣泛關(guān)注。其中MIPS在藥物分離方面研究占了相當(dāng)大的比例，從混合物中提取目標藥物，分離結(jié)構(gòu)類似物，以及手性結(jié)構(gòu)藥物的分離，MIPS的功能在不斷強大，它在藥物分離領(lǐng)域的地位也在不斷提升。本文綜述了MIPS在藥物分離中的研究， MIPS功能單體的選擇并預(yù)言了未來的發(fā)展方向。

分子印跡；分離；手性藥物；蛋白質(zhì)；功能單體

分子印跡技術(shù)是模仿“抗原-抗體”識別原理發(fā)展的一種特異性識別目標分子的技術(shù)[1]。它是以欲識別的分子為模板，通過共價或非共價鍵的方式與一種或兩種功能單體結(jié)合生成聚合物，然后用特定的溶劑將模板分子洗脫，得到分子印跡聚合物(MIPS)。由于印跡分子的存在，在聚合過程中，功能單體本身所帶的基團會根據(jù)與印跡分子的相互作用，在印跡分子周圍形成具有特定空間構(gòu)象的分子印跡聚合物，這種聚合物對模板分子有特異性識別功能。

由于分子印跡技術(shù)操作簡單，對目標分子的特異性識別能力強，近年來在越來越多的領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。本文就MIPS在藥物分離方面的研究、MIPS功能單體的選擇以及研究前景做一綜述。

1 MIPS用于藥物分離

1.1從天然藥物中分離有效成分 從天然藥物中分離有效成分是藥物分離領(lǐng)域的一個研究熱點。

維生素E是一種脂溶性維生素，又稱生育酚，是最主要的抗氧化劑之一，隨著近代醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家認為與合成品相比，天然維生素E無論是從生理活性還是抗氧化能力均優(yōu)于合成維生素E[2]。在國外，其醫(yī)藥、食品及化妝業(yè)上得到廣泛應(yīng)用的合成維生素E已逐漸被天然維生素E所取代[3]。但由于天然維生素E的提取比較困難，目前市場上主要還是使用合成維生素E。Faizal等[4]以甲基丙烯酸做功能單體，丙烯腈做交聯(lián)劑，用相轉(zhuǎn)換法制備了維生素E印跡聚合物膜，結(jié)果表明單位質(zhì)量的膜對維生素E的吸附量是非印跡膜的10倍，通過與吸附δ-生育酚和4-色原烷醇比較，發(fā)現(xiàn)印跡膜對維生素E的吸附和選擇性更好。作者還將功能單體變?yōu)殚g苯二酚杯芳烴[4]，與模板分子以非共價鍵的方式結(jié)合，制備了維生素E分子印跡膜，與先前制備的膜相比，發(fā)現(xiàn)印跡膜對目標分子的選擇性是非印跡膜的近2倍[5]。Piacham等[6]則是制備了維生素E印跡的納米球，考察了其選擇性，發(fā)現(xiàn)每10 mg印跡聚合物對維生素E的選擇性是非印跡聚合物的2倍多。

姜黃素是姜黃的主要成分，有很好的抗癌和抗氧化活性，從姜黃中提取姜黃素用于疾病治療是很有意義的。Wang等[7]用甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸合成了姜黃素分子印跡聚合物膜，分別考察了其對姜黃素，去甲氧基姜黃素和二去甲氧基姜黃素的選擇識別能力，結(jié)果表明印跡膜對姜黃素的選擇性分別是去甲氧基姜黃素和二去甲氧基姜黃素的1.50倍和5.94倍，可見，該膜對有效富集姜黃素有很好的應(yīng)用前景。

另外，還有許多分子印跡技術(shù)用于提取天然藥物活性部位。Zhang等[8]以甲基丙烯酰氯做功能單體，用相轉(zhuǎn)換法制備了毛地黃黃酮印跡聚合物膜，考察其對結(jié)構(gòu)類似物蕓香苷的選擇性識別能力，結(jié)果印記聚合物對目標分子的結(jié)合量為28.6 mg/g，而非印記聚合物的結(jié)合量只有3.67 mg/g，印記膜對毛地黃黃酮的分離因子(即目標分子與結(jié)構(gòu)類似物在滲透液和空白液濃度的比值)為10.78，表明聚合物膜對毛地黃黃酮的識別能力更好。Zhai等[9]制備了薯蕷皂苷印記的核殼結(jié)構(gòu)納米粒，從穿龍薯蕷的粗提物中提取到了大量的薯蕷皂苷，第一次得到的產(chǎn)物用HPLC檢測，薯蕷皂苷的回收率達90%，純度超過98%，與傳統(tǒng)的提取方法相比，降低了成本，提高了目標產(chǎn)物的純度。

1.2分離具有藥理活性的對映異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)類似物 在天然和合成的藥物中有許多手性化合物，其對映體的藥理活性和毒性往往有很大差異，有時甚至相反[10]。而在世界范圍內(nèi)已經(jīng)上市的藥物中又有超過1/3的藥物是手性的[11]?？梢姡中运幬锏姆蛛x對于合理用藥是必不可少的。目前用于手性藥物分離的技術(shù)主要有氣相色譜(GC)，高效液相色譜(HPLC)，色譜柱電泳(CE)或者毛細管柱電泳(CEC)，這些方法對目標分子的特異性都不是很高，有時會對藥物分子產(chǎn)生錯誤識別，從而影響藥物的純度[11]。近年來廣受關(guān)注的MIPS在克服這些缺點方面有一定的優(yōu)勢，在這方面的研究也成為一大熱點。

萘普生是2-芳基丙酸的衍生物，為一種常用的非甾體抗炎藥，其S-構(gòu)型的藥理活性是R-構(gòu)型的30倍，分離該手性藥物對提高藥物的療效有很好的作用。Wang等[12]用4-乙烯基-氮苯做功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯做交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈做引發(fā)劑，制備了S-萘普生的分子印跡聚合物膜，測得S-萘普生與4-乙烯基-氮苯的結(jié)合常數(shù)為13.8 M-1,用HPLC檢測，結(jié)果顯示印記膜能成功的將S-萘普生和R-萘普生進行分離。

熊去氧膽酸是一種肝臟疾病治療藥，可促進膽汁分泌，溶解膽結(jié)石中的膽固醇，一般通過將鵝去氧膽酸電化學(xué)轉(zhuǎn)化為熊去氧膽酸制備，但這種方法一般得到的是鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的混合物，它們是一種同分異構(gòu)體，且很難分離，這就限制了熊去氧膽酸的應(yīng)用。Xu等[13]分別用丙烯酰胺和α-甲基丙烯酸做功能單體，加入致孔劑CaCO3,制備了熊去氧膽酸印跡的核殼微球，發(fā)現(xiàn)用甲基丙烯酸做功能單體有更好的分離效果，用甲基丙烯酸做功能單體時，非印記聚合物與印記聚合物對目標分子的吸附量分別是13.93 mg/g和43.52 mg/g，印記聚合物對目標分子的分離因子為2.2，可見該聚合物能將熊去氧膽酸的同分異構(gòu)體進行有效分離，解決了用鵝去氧膽酸轉(zhuǎn)換制備熊去氧膽酸，混合物難以分離的問題。

他汀類藥物是一種還原酶抑制劑，一般以兩種構(gòu)型存在：內(nèi)酯結(jié)構(gòu)和含氧酸形式。在體內(nèi)，含氧酸形式的為活性藥物，可降低血漿膽固醇濃度，而內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的沒有活性。Wang等[14]在制備洛伐他汀酸分子印跡聚合物膜時，采用聚偏二氟乙烯超濾膜做支撐體來提高膜的機械強度，促進洛伐他汀酸從水溶液中分離出來，降低洛伐他汀生產(chǎn)的成本，具有很好的應(yīng)用前景。

1.3分離氨基酸、肽類藥物等

1.3.1分離氨基酸 氨基酸是生物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)成分之一。目前上市的大多數(shù)氨基酸價格昂貴，主要原因之一就是氨基酸的分離提純比較困難。Huang等[15]針對表面印跡分子構(gòu)型容易改變的問題，選擇具有高導(dǎo)電率又環(huán)保的聚吡咯制備了分子印跡聚吡咯納米線，保留了納米材料表面印跡后的手性催化特性，用這種單分散的聚吡咯納米線進行手性催化識別時，比大塊的印跡膜有更高的敏感性和更短的響應(yīng)時間，對苯丙氨酸對映體及其結(jié)構(gòu)類似物樟腦酸對映體都有很好的識別能力，在氨基酸的富集等方面有很好的應(yīng)用前景。

賴氨酸在pH值為1.19和2.08時是以L-和R-兩種構(gòu)型存在的，而L-賴氨酸在非極性溶液中不溶，Panahi等[16]利用反相吸附的原理，制備了L-賴氨酸的印跡聚合物，通過分子印跡的聚合物進行固相萃取，進而從L-賴氨酸的稀溶液中萃取L-賴氨酸，結(jié)果表明L-賴氨酸印跡的聚合物在最佳條件時對L-賴氨酸和D-賴氨酸的回收率分別是96%和58%，相應(yīng)的分配系數(shù)為8 000和460。印跡聚合物在最佳條件時對L-賴氨酸的吸附量為27.26 mg/g, 可見該聚合物可以將L-賴氨酸從其混合構(gòu)型的溶液中分離。

1.3.2分離肽類藥物 與氨基酸相比，肽類因為有更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，使得分離提純顯得更加困難。Papaioannou等[17]分別用甲基丙烯酸和丙烯酰胺作功能單體，二甲基乙二醇、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和N,N-二甲基雙丙烯酰胺作交聯(lián)劑，制備了6種Arg-Gly-Asp(RGD)印跡的聚合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基丙烯酸和三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯組的效果最好，再吸附率和印跡系數(shù)分別為12.3%和2.44，與其他組相比，該聚合物有較低的解離常數(shù)和較高的理論結(jié)合位點，實驗比較了聚合物對RGD及其類似物L(fēng)ys-Gly-Asp和其他多肽如短桿菌肽的特異性選擇性，選擇系數(shù)分別為1.98，1.27和1.67，可見該聚合物可以從含有RGD的混合多肽類中有效的分離出來。

在用分子印跡技術(shù)進行手性分離時，從氨基酸殘渣中分離含不對稱碳原子氨基酸的研究已經(jīng)很多，而20種天然氨基酸中只有甘氨酸沒有手性碳,因此，可以說，對從氨基酸殘渣中分離甘氨酸還是一大難點，Itou等[18]針對這一問題，通過將甘氨酸與N-α-叔丁氧羰基色氨酸(Trp分別是D-和L-構(gòu)型)連接，得到含甘氨酸的四肽，即間接的把甘氨酸轉(zhuǎn)換成具有手性的分子，然后印跡聚苯乙烯樹脂膜，實驗結(jié)果證明該膜對含有甘氨酸的四肽有手性分離功能。

1.3.3分離蛋白質(zhì)類藥物 基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展極大地促進了以胰島素、干擾素、白介素和單克隆抗體等為代表的多肽和蛋白質(zhì)類藥物的研究與開發(fā)，使之成為現(xiàn)代醫(yī)藥產(chǎn)品研究發(fā)展的方向[19]。但因為分離提純代價昂貴，這就限制了一些蛋白質(zhì)藥物的批量生產(chǎn)。

牛血清蛋白是一種應(yīng)用很廣的蛋白質(zhì)，Li等[20]用水溶性的3-氨基苯酸作功能單體，在聚合物中加入超順磁的氧化鐵，制備了含多層核殼結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯磁納米粒，第1次用于蛋白(牛血紅蛋白)分離，該納米粒很容易達到吸附平衡，在外磁場作用下可進行磁性分離和富集。Lu等[21]也用聚苯乙烯制備了表面印跡牛血清蛋白的微粒，但只有印跡了牛血紅蛋白的粒子對溶液中的牛血紅蛋白有識別能力，而牛血清白蛋白的粒子卻沒有達到預(yù)期的效果。

溶解酵素是用來診斷多種疾病，包括結(jié)核病和真菌性腦膜炎的常用試劑。Zhang等[22]認為選擇合理的功能單體是改進蛋白印跡的重要方法，他們用丙烯-β-環(huán)糊精和丙烯酰胺作功能單體，為模板分子提供一個外部親水內(nèi)部疏水的自組裝環(huán)境，用硅粉代替硅膠在其表面印跡了溶解酵素，考察了其在含有溶解酵素的混合溶液中對目標分子的識別能力，結(jié)果證明效果較好。Qin等[23]則是用蛋白印跡的聚合物作為HPLC的固定相對蛋白進行分離。傳統(tǒng)的表面引發(fā)自由基聚合過程中發(fā)生的溶液聚合和凝膠化反應(yīng)，在聚合物作為固定相時，過量的聚合物溶液會導(dǎo)致不同的識別位點和拖尾峰，為解決這些問題，他們加入二硫代氨基甲酸鹽做引發(fā)-轉(zhuǎn)移-終止劑，用中空的氯甲基化聚苯乙烯作支撐體，丙烯酰胺作功能單體，N,N-亞甲基雙丙烯酰胺作交聯(lián)劑，在其表面印跡溶解酵素。因為利用了表面引發(fā)自由基聚合，聚合物層的厚度得到了控制，響應(yīng)性更好，印跡效果也較傳統(tǒng)的自由基聚合的好，與非印跡的聚合物相比有明顯的優(yōu)越性。

病毒也是一種受到廣泛關(guān)注的蛋白質(zhì)，目前大多是在有機溶劑中進行研究，而在水環(huán)境下的研究相對較少，Bolisay等[24]選擇了一種很典型的煙草花葉病毒，將病毒印跡在聚合物上，考察其對水溶液中病毒的選擇性和吸附目標分子的能力，結(jié)果聚合物對煙草花葉病毒的吸附量為8.8 mg/g，對煙草壞死病毒的吸附量僅為4.2 mg/g，而沒有印跡的聚合物對煙草花葉病毒和煙草壞死病毒沒有任何選擇性，可見印跡聚合物對目標蛋白有很好的選擇性。

2 功能單體的選擇

合適的功能單體是印跡成功，保證MIPS具有良好識別功能的關(guān)鍵。一般按照以下原則進行選擇：酸性模板分子選堿性功能單體，堿性模板分子選酸性功能單體，中性模板分子選擇中性或酸性功能單體，特殊情況還可以選用雙功能或多功能單體。目前較成熟的優(yōu)化方法有：紫外-可見分光光度法、核磁共振法、熒光光譜法、計算機模擬計算等[25]。林秋明等[26]考慮到槲皮素的多羥基結(jié)構(gòu)能與功能單體形成氫鍵，分別用三種功能單體(甲基丙烯酸、丙烯酰胺、2-乙烯基吡啶)制備MIPS，分析不同MIPS與槲皮素作用后，槲皮素紫外光譜的變化，結(jié)果以2-乙烯基吡啶做功能單體制備的MIPS與槲皮素結(jié)合后紫外光譜吸收變化最大，認為對槲皮素的識別能力也最強。Kowalska等[27]認為預(yù)聚混合物分子之間的作用力對制備出具有特異識別功能的MIPS有很大的影響。他們用量子化學(xué)計算預(yù)聚混合物分子之間的作用力，并用密度泛函檢驗，最后確定模板分子哈爾滿堿與功能單體甲基丙烯酸之間的作用力最強。

3 展望

隨著分子印跡技術(shù)的發(fā)展，它在藥物分離領(lǐng)域的研究也越來越多，Chen等[28]將分子印跡技術(shù)與電化學(xué)結(jié)合起來制備了一種分離色氨酸對映體的電極柱。由于聚吡咯可逆的摻雜/去摻雜特性以及良好的導(dǎo)電性，在電極電勢為正時會發(fā)生過氧化，電子給予體含氧基團的引入可引起L-色氨酸的去摻雜，形成可以拔出模板分子的陰離子結(jié)構(gòu)互補腔。在電壓為1.2 V的條件下，用L-色氨酸印跡以后把它作為電極柱的固定相。在將流動相泵入電極柱時將電壓設(shè)為-0.4 V，調(diào)節(jié)流動相的pH值到1.6，該值遠遠小于色氨酸的等電點，在色氨酸進入電極柱時L-色氨酸和D-色氨酸都帶上了正電荷，當(dāng)色氨酸與固定相接觸后，L-色氨酸受分子印跡和靜電作用的協(xié)同效應(yīng)被富集下來，而D-色氨酸由于只受到微弱的靜電吸引，故不能被保留，從而將L-色氨酸和D-色氨酸分離。

可見，分子印跡技術(shù)用于藥物分離已經(jīng)有了更多的策略，與電化學(xué)、生物化學(xué)等聯(lián)用的分子印跡技術(shù)將會越來越快的被應(yīng)用到藥物分離，相信未來的分子印跡技術(shù)會為藥物分析領(lǐng)域作出應(yīng)有的貢獻。

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2010-04-14

[修回日期] 2010-09-25

Progressofmolecularimprintingtechniqueindrugseparation

KONG Dan-feng1, ZHAO Wen1, LU Ting-li1, HUI Qian-qian1,WANG Yun-qing1, CHEN Tao1,2

(1.Key Laboratory for Space Biosciences & Biotechnology Faculty of Life Science, Northwestern Polytechnical University, Xi'an 710072, China; 2.Xi'an Libang Pharmaceuticals Co.,Ltd , Xi'an 710075, China)

Molecularly imprinted polymer drawn much attention for its specific identification function. Among all the research about MIPS, drug separation takes a large proportion. MIPS played an important role in extracting the target-drug from mixture, separating structure analogues and chiral drug, which enhanced the position of MIPS in the field of drug separation. In this paper, the research of MIPS in drug separation and the choice of MIPS functional monomer had been summarized, and the development direction in the future had also been predicted.

molecularly imprinted; separation; chiral drugs; protein; functional monomer

孔丹鳳(1986-)，女，碩士研究生.E-mail:k-df@163.com.

陳 濤. E-mail:taochen@libang.com.cn.

R963

A

1006-0111(2011)03-0161-04