宋殿榮 ，王雅楠 ，張 崴，朱 澤 ，郭 潔

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，天津 300150；2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

小半夏加茯苓湯是《金匱要略》中經(jīng)典止嘔方劑，能夠散飲降逆，和胃止嘔，治療“妊娠惡阻”療效顯著。半夏可否用于妊娠期疾病的治療，是醫(yī)家們爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，清半夏含藥血清無明顯胚胎毒性。本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞增殖和分化的影響，綜合評(píng)價(jià)其胚胎毒性，為該方在妊娠期的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 健康未交配過的Wistar雄鼠30只，體質(zhì)量（230±10）g，許可證編號(hào)：SCXK（津）2009-0001。天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中10只灌服小半夏加茯苓湯水煎液、10只灌服清半夏水煎液、10只灌服生理鹽水做對(duì)照。

1.2 藥物 小半夏加茯苓湯組成：清半夏18 g，生姜15 g，茯苓9 g，制備成含生藥1 kg/L。清半夏18 g，制備成水煎液含生藥0.5 kg/L，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[1]與《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[2]，給藥劑量=臨床常用量×動(dòng)物等效劑量系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)的稀釋度，即動(dòng)物等效劑量×培養(yǎng)基內(nèi)的稀釋度。大鼠（200 g）與人（70 kg）之間等效劑量系數(shù)為6.3，培養(yǎng)基內(nèi)的稀釋度為5（體外反應(yīng)系統(tǒng)中含藥血清添加量按20%計(jì)算），最終給藥劑量小半夏加茯苓湯組為18.9g/（kg·d）、半夏組為8.1g/（kg·d）。等體積灌服生理鹽水，連續(xù)給藥3 d，末次灌胃后1～2 h腹主動(dòng)脈取血，靜置離心，滅活濾菌，保存?zhèn)溆?。制備小半夏加茯苓湯含藥血清、清半夏含藥血清和空白血清?/p>

1.3 細(xì)胞 鼠胚成纖維細(xì)胞（MEF）和胚胎干細(xì)胞-D3（ES-D3）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化細(xì)胞研究所。

1.4 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自英國GIBCO公司，胎牛血清（FBS）、β-巰基乙醇（β－ME）、非必需氨基酸（NEAA）、明膠、絲裂霉素 C、白血病抑制因子（LIF）、噻唑藍(lán)（MTT）均購自Sigma公司?？俁NA提取試劑盒（TIANGEN DP419），cDNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN KR104），2×Taq PCR MasterMix試劑盒（TIANGEN KT201）。

1.5 ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)[3]取出液氮中的ES細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，接種于備用的MEF飼養(yǎng)層，加入內(nèi)含 20%FBS、0.1mmol/Lβ-ME、1%NEAA 及 1×106U/L的LIF維持培養(yǎng)。為保持其理想的未分化狀態(tài)，當(dāng)胚胎干細(xì)胞團(tuán)集落達(dá)到60%～70%融合時(shí)，即需傳代。

1.6 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性 消化ES細(xì)胞，差速貼壁后用含20%FBS的培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以500個(gè)/孔的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，分為 A、B、C、D組，分別加入含有20%小半夏加茯苓湯含藥血清的培養(yǎng)液（A組）、含有20%清半夏含藥血清的培養(yǎng)液（B組）、含有20%空白血清的培養(yǎng)液（C組）及含有20%FBS的培養(yǎng)液（D組），終體積為100 μL。每組共設(shè)6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72、96 h，每孔加入 20 μL MTT溶液（5 g/L），5%CO2、95%濕度、37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄培養(yǎng)液上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩10 min顯色。待沉淀完全溶解后，用波長(zhǎng)為630 nm的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其吸光度（OD）值。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 ES細(xì)胞分化培養(yǎng)—懸滴—懸浮—貼壁[4]收集ES細(xì)胞分別加入A、B、C、D 4種培養(yǎng)液吹打，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至3.75×107個(gè)/L，分組同上。取每滴20 μL的單細(xì)胞懸液，以80滴/培養(yǎng)皿置于10cm細(xì)菌培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上，將皿蓋翻轉(zhuǎn)至正常位置，培養(yǎng)皿內(nèi)加入PBS于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)3 d。每個(gè)懸滴內(nèi)均含有1個(gè)干細(xì)胞團(tuán)，即擬胚體（EB）。吸取 PBS，分別加入 A、B、C、D 培養(yǎng)液，45°角拿取培養(yǎng)皿蓋子，將EBs沖入培養(yǎng)皿底，輕晃培養(yǎng)液，使EBs懸浮于培養(yǎng)液中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。吸取EB分別接種至事先用明膠包被的24孔板內(nèi)，輕輕振動(dòng)，使EB置于孔中央，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。觀察24孔板內(nèi)可見ES細(xì)胞分化成為具有收縮能力的心肌細(xì)胞，進(jìn)行ES細(xì)胞分化能力檢測(cè)。

1.8 半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)戏磻?yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)心肌細(xì)胞特異基因（β-MHC）的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行濃度和純度的鑒定，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后PCR擴(kuò)增。肌球蛋白重鏈基因（β－MHC）為ES細(xì)胞中分化的心肌細(xì)胞特異表達(dá)基因，GAPDH為內(nèi)對(duì)照管家基因，目的基因和管家基因的引物經(jīng)NCBI BLAST檢索無顯著同源性序列，具體引物序列和擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度見表1。PCR反應(yīng)體系為：Template 2 μL，F(xiàn)orwardprimer（10 μmol/L）2.0 μL，Reverseprimer（10μmol/L）2.0 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

表1 β-MHC和GAPDH引物序列和擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequences and amplified fragment length of β-MHC and GAPDH

1.9 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳和半定量分析 取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳觀察，緩沖液為0.5×TBE，電壓為100 V，電泳30 min后紫外燈下觀察結(jié)果。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，得到相應(yīng)的光密度值，求出各組目的條帶的光密度比值（ODMHC/GAPDH）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)ES增殖的影響 在連續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96h，小半夏加茯苓湯含藥血清培養(yǎng)的ES細(xì)胞增殖迅速，在細(xì)胞數(shù)量和活性方面均與FBS、空白血清、清半夏含藥血清相似，表明小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)ES生長(zhǎng)無抑制作用，見表2。

2.2 對(duì)ES分化的影響 小半夏加茯苓湯含藥血清培養(yǎng)下的ES細(xì)胞分化程度和分化為心肌細(xì)胞特異基因β-MHC的表達(dá)水平，與清半夏含藥血清、空白血清和FBS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。其灰度比值MHC/GAPDH接近于1，表明小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)胚胎干細(xì)胞向心肌分化無抑制作用，見圖1和表3。

表2 小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)ES增殖的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoction-containing serum on the proliferation of ESCs（±s，n=6）

表2 小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)ES增殖的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoction-containing serum on the proliferation of ESCs（±s，n=6）

注：與各組比較，△P>0.05。

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圖1 小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)ES分化為心肌β-MHC表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoctioncontaining serum on the β-MHC mRNA of cardiac myoblasts differentiated by ESCs

表3 小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)ES分化為心肌β-MHC表達(dá)的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoctioncontaining serum on the β-MHC mRNA expression of cardiac myoblasts differentiated by ESCs（±s，n=6）

表3 小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)ES分化為心肌β-MHC表達(dá)的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoctioncontaining serum on the β-MHC mRNA expression of cardiac myoblasts differentiated by ESCs（±s，n=6）

注：與各組比較，△P>0.05。

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3 討論

有關(guān)半夏毒性的研究屢有文獻(xiàn)報(bào)道，但經(jīng)炮制或配伍后其毒性是否有所改變，歷代醫(yī)家說法不一。本課題前期研究結(jié)果顯示炮制后的清半夏無明顯胚胎毒性。半夏與生姜配伍是出自《金匱要略》之中醫(yī)止吐祖方——小半夏湯。半夏與生姜均有降逆止嘔、和胃化痰之功，合用相須起協(xié)同增效作用，對(duì)痰飲滯中、胃失和降的嘔吐效果尤佳，醫(yī)圣張仲景將兩者合用創(chuàng)小半夏湯治“諸嘔吐，谷不得下者”，成為治嘔之祖劑，并在此方基礎(chǔ)上加入淡滲利水、寧心益脾的茯苓以針對(duì)飲邪深重、甚則凌心蔽陽的嘔吐證而制成小半夏加茯苓湯，成為治本澄源、治濕痰留飲之主方。

胚胎干細(xì)胞是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的具有多向分化潛能的細(xì)胞，其分化過程能夠在分子水平重演胚胎發(fā)育過程，為哺乳動(dòng)物的生殖發(fā)育毒理等方面的研究提供了非常有價(jià)值的體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。該實(shí)驗(yàn)按臨床常用制半夏配伍之小半夏加茯苓湯作為研究對(duì)象，通過胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究小半夏加茯苓湯對(duì)胚胎干細(xì)胞增殖和分化的影響，結(jié)果表明小半夏加茯苓湯含藥血清對(duì)ES增殖和分化為心肌細(xì)胞特異性基因β-MHC的表達(dá)均無抑制作用，提示該實(shí)驗(yàn)劑量下未見胚胎發(fā)育毒性。

該實(shí)驗(yàn)采用含藥血清作為受試物，觀察藥物對(duì)細(xì)胞的影響，研究中藥的胚胎毒性，考慮了藥物的體內(nèi)代謝過程，對(duì)臨床應(yīng)用具有指導(dǎo)價(jià)值。該課題還將進(jìn)一步對(duì)血清中的含藥成分進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，為半夏及小半夏加茯苓湯的胚胎毒性研究提供更準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

[1]劉建文.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)新技術(shù)與新方法[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：258－261.

[2]孫敬方.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：150－194.

[3]Eisenbrand G，Baker V.Methods of in vitro toxicology[J].Food Chem Toxicol,2002,40(2-3):193-236.

[4]Chen R，Chen J，Cheng S，et al.Assessment of embryotoxicity of compounds in cosmetics by the embryonic stem cell test[J].Toxicol Mech Methods,2010,20(3):112-118.