宋春敬，劉曉帆，孫艷明，李廣斌，陳 靜，李海霞，李瑞環(huán)，王 玲

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院，天津 300020；3.天津市胸科醫(yī)院，天津 300051；4.天津市大港醫(yī)院，天津 300270）

內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。1997年Asahara等[1]最先研究發(fā)現(xiàn)成年個(gè)體外周血中存在骨髓來(lái)源的血管EPSs，能夠參與生后血管再生過程。EPCs主要定居于骨髓，一般狀態(tài)下外周血液中EPCs的數(shù)量很少，在月經(jīng)和妊娠等生理狀態(tài)下或血管損傷、組織缺血等病理狀態(tài)下，EPCs能夠被動(dòng)員出骨髓，向外周血遷移，增加外周血中EPCs的數(shù)量，并進(jìn)一步歸巢到血管新生組織，形成新的血管。卵巢黃體是發(fā)生生理性血管新生少數(shù)幾個(gè)成年組織之一，黃體血管新生與黃體功能密切相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的EPCs參與黃體的血管新生[2]。滋腎調(diào)沖法是治療黃體功能不全性功血的治療法則，其代表方功血寧Ⅱ號(hào)方不僅明顯改善臨床癥狀，而且能夠健全黃體功能[3-4]。補(bǔ)腎中藥具有補(bǔ)骨填精益髓作用，使腎精充足，骨髓充盈，促進(jìn)造血。因此可以認(rèn)為，EPCs定居在骨髓，屬骨中之髓，具滋腎調(diào)沖作用的功血寧Ⅱ號(hào)方可能有助于將骨髓中的EPCs動(dòng)員出來(lái)向外周血遷移，進(jìn)而參與黃體的血管新生。為此本研究以同種異體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植的假孕動(dòng)物模型為研究對(duì)象，觀察功血寧Ⅱ號(hào)方對(duì)動(dòng)物外周血EPCs數(shù)量的影響，探討其對(duì)骨髓EPCs的動(dòng)員作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠為供鼠，共48只，體質(zhì)量200～220 g。清潔級(jí)Wistar雌性大鼠為受鼠，共174只，體質(zhì)量180～200 g，由天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 功血寧Ⅱ號(hào)方組成：熟地黃15 g，山茱萸 10 g，山藥 15 g，女貞子 15 g，枸杞子 15 g，當(dāng)歸 15 g，白芍 15 g，菟絲子 15 g，仙靈脾 15 g，香附10 g。購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬?？滇t(yī)院。烏雞白鳳丸，天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠產(chǎn)品，每丸9 g。批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z12020010。妊馬血清促性腺激素（PMSG），寧波第二激素廠生產(chǎn)，獸藥字（2006）110254564。人絨毛膜促性腺激素（HCG），上海生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：0409013。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；大鼠淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；4，6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI），Sigma公司產(chǎn)品；免疫試劑Ⅰ抗工作液[含山羊抗大鼠CD133和CD34多克隆抗體（1∶50），其中CD34為藻紅蛋白（PE）標(biāo)記（CD34-PE）]，購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司，Ⅱ抗工作液[含異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的兔抗山羊 IgG（1∶50）]，英國(guó) ABCAM 公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 400E型普通離心機(jī)；日本OLYPUS-BHT光學(xué)顯微鏡；LEIKA DM3000熒光共聚焦顯微鏡；德國(guó)Biofuge Fresco低溫冷凍高速離心機(jī)；美國(guó)FACSCalibur流式細(xì)胞儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離與標(biāo)記 將供體雄性大鼠以頸椎脫臼法處死，于無(wú)菌條件下獲取兩側(cè)股骨，用DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，加于大鼠淋巴細(xì)胞分離液之上，以2000 r/min離心20 min，吸取中間白色界面層，用磷酸鹽（PBS）緩沖液洗滌2次，以1200 r/min離心10 min，制備骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。加入終濃度為50 mg/L的DAPI調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～3）×1010/L。放入37℃培養(yǎng)箱中孵育45 min。在熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞染色率＞90%，提示DAPI成功標(biāo)記骨髓單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2 受體大鼠的預(yù)處理 受體大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，每周以有效氯消毒鼠籠1次，經(jīng)飼料、墊料均高溫高壓消毒。移植前3 d開始飲用含霉素（250 mg/L）和慶大霉素（32000 U/L）的無(wú)菌酸化水，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。照射前將大鼠卵巢部位用鉛皮箍綁后，置于無(wú)菌透氣的塑料瓶中，采用137Cs射線全身照射。照射劑量為7.5 Gy，劑量率為0.74 Gy/min。照射后6 h內(nèi)，受體大鼠經(jīng)尾靜脈注入供鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液 1 mL（2×107）。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥 將受體大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為移植對(duì)照組、功血寧Ⅱ號(hào)組和烏雞白鳳丸組，每組48只，另取未照射大鼠（30只）尾靜脈輸注等量培養(yǎng)液作為假孕對(duì)照組，共4組。參照“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比率表”，功血寧Ⅱ號(hào)方劑量為12.6 g/（kg·d）。中藥煎煮30 min，共2次，合并煎液過濾，濃縮成濃度為1.3 kg/L的水煎劑，4℃保存?zhèn)溆?。烏雞白鳳丸組給予烏雞白鳳丸，用蒸餾水配成混懸液，藥物劑量為1.62 g/（kg·d），藥物濃度為0.162 kg/L，骨髓移植后24 h開始給藥，各組均按10 mL/kg灌胃給藥。假孕對(duì)照組和移植對(duì)照組給予等容積的生理鹽水。動(dòng)物每日定時(shí)灌胃給藥2次，連續(xù)給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.4 外周血象觀察 無(wú)菌條件下采取移植第7天（+7d）、+15d大鼠眼內(nèi)眥血，動(dòng)態(tài)檢測(cè)外周血象變化。

1.2.5 假孕大鼠模型的制備 受體大鼠于造血重建后，各組每只頸部皮下注射50 IU PMCG，48 h后每只皮下注射30 IU HCG，注射HCG 24 h后定為假孕第1天。

1.2.6 動(dòng)物處理和標(biāo)記細(xì)胞觀察 在假孕第3、7、13天（相當(dāng)于黃體早、中、晚期），各組分別處理存活的1/3大鼠，眼內(nèi)眥球后靜脈叢取血，血液涂片，即時(shí)熒光顯微鏡下觀察DAPI標(biāo)記骨髓單個(gè)核細(xì)胞在血液中的分布。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血EPCs數(shù)量 采取大鼠眼內(nèi)眥球后靜脈叢血液1 mL于EDTA抗凝管中，加入PBS緩沖液1 mL混勻，加入淋巴細(xì)胞分離液中（2∶3），室溫下 2400 r/min 離心 20 min，吸取中間白膜層，PBS緩沖液清洗3次，得到單個(gè)核細(xì)胞。取100 μL單個(gè)核細(xì)胞加入FITC標(biāo)記的抗體CD133（間標(biāo)）和CD34-PE，避光孵育10 min，同型抗體作陰性對(duì)照，加入含0、5%BSA的PBS緩沖液洗滌，室溫1500r/min離心后加人500μL PBS（5%BSA）緩沖液上機(jī)分析。流式細(xì)胞儀分析200000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)CD34-PE和CD133-FITC雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，即內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠移植后生存情況 移植各組大鼠+1 d～+7 d一般狀態(tài)正常，+7 d以后一般狀態(tài)開始下降，各組均有動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的毛色雜亂，食欲減退，體質(zhì)量下降等，移植對(duì)照組較功血寧組和烏雞白鳳丸組出現(xiàn)時(shí)間早且較為明顯。+14 d一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)。移植各組大鼠從+13 d至+20 d均有動(dòng)物死亡。移植對(duì)照組存活率約為60%，余29只。烏雞白鳳丸組存活率約為64%，余31只。功血寧Ⅱ號(hào)組存活率約為71%。余34只。

2.2 大鼠移植后造血重建 移植各組大鼠+7 d外周血白細(xì)胞和血小板降至最低，15 d移植各組大鼠白細(xì)胞和血小板上升，基本恢復(fù)正常。

2.3 DAPI標(biāo)記細(xì)胞在血液中的分布 DAPI在波長(zhǎng)為358 nm的激發(fā)光作用下發(fā)出藍(lán)色熒光。熒光顯微鏡下顯示，移植各組大鼠黃體早、中、晚期血液涂片均可見核呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞，黃體早期數(shù)量多，功血寧Ⅱ號(hào)組尤為明顯（見圖1），假孕對(duì)照組未見核呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞。

圖1 功血寧Ⅱ號(hào)組黃體早期血液涂片，可見核呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞Fig.1 Blood smear of early luteal stage in Gongxuening II group,in which cell with blue fluorescent nucleus can be seen

2.4 各組大鼠黃體早、中、晚期外周EPCs數(shù)目的比較 見表1。

表1 各組大鼠黃體早中晚期外周血EPCs數(shù)目比較（±s）Tab.1 Comparison of the number of peripheral endothelial progenitor cells of rats in early,middle and later luteal stage in each group（±s）個(gè)/20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞

表1 各組大鼠黃體早中晚期外周血EPCs數(shù)目比較（±s）Tab.1 Comparison of the number of peripheral endothelial progenitor cells of rats in early,middle and later luteal stage in each group（±s）個(gè)/20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞

注：與假孕對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與移植對(duì)照組比較，*P＜0.05；與功血寧Ⅱ號(hào)組比較，○P＜0.05；與同組早期比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與同組中期比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。

組別 n 黃體早期 n 黃體中期 n 黃體晚期假孕對(duì)照組 1032.36±6.361028.40±5.721021.30±5.77▲▲●移植對(duì)照組 1038.20±7.711035.30±6.11△ 926.60±4.09▲▲●●功血寧Ⅱ號(hào)組 1146.10±7.72△△* 1240.70±5.76△△ 1131.10±7.49△△▲▲●●烏雞白鳳丸組 1139.0±7.87△○ 1037.73±6.60△△ 1028.09±6.56△▲▲●●

表1所示，各組外周血EPCs數(shù)目，黃體早期最多，中期略有減少，晚期明顯減少，與早、中期相比均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。功血寧Ⅱ號(hào)組、烏雞白鳳丸組黃體各期EPCs數(shù)目均較假孕對(duì)照組顯著增多（P＜0.05或 P＜0.01）；功血寧Ⅱ號(hào)組早期EPCs數(shù)目較移植對(duì)照組和烏雞白鳳丸組顯著增多（P＜0.05）。

3 討論

骨髓單個(gè)核細(xì)胞中存在許多種類的成體干細(xì)胞，EPCs是其中重要的一種。骨髓單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)過培養(yǎng)，誘導(dǎo)后可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。移植骨髓單個(gè)核細(xì)胞能夠歸巢于缺血部位并表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志，原因是與其中含有的EPCs引起的血管發(fā)生有關(guān)[5]。EPCs的識(shí)別主要依靠細(xì)胞表面標(biāo)記，目前普遍認(rèn)為CD34、CD133和VEGFR-2（Flk-1或KDR）是其基本表型特征，并以CD34+/CD133+或者CD34+/KDR識(shí)別EPCs。本研究在給受鼠大鼠移植骨髓單個(gè)核細(xì)胞后，以CD34+/CD133+作為EPCs的標(biāo)記物，觀察其外周血中CD34+/CD133+雙標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量變化。

骨髓中的EPCs經(jīng)各種因素刺激后向外周血遷移，增加外周血EPCs的數(shù)量，稱為EPCs的動(dòng)員。組織的血管新生是重要的動(dòng)員因素。黃體是成年個(gè)體發(fā)生血管新生的少數(shù)組織之一，無(wú)論是月經(jīng)黃體還是妊娠黃體，在其新生血管形成的過程中，作為動(dòng)員因素可增加外周血EPCs的數(shù)量。有研究表明，妊娠婦女外周血EPCs的數(shù)量在妊娠期明顯增加[6]。

本研究觀察到，假孕對(duì)照組在黃體早期EPCs數(shù)目最高，中期略有下降，至晚期明顯減少，其變化與文獻(xiàn)報(bào)道的強(qiáng)烈的血管新生發(fā)生在早黃體期，中期血管發(fā)育成熟和晚期血管退化相一致[7]，表明黃體生理性的血管新生對(duì)骨髓EPCs具有動(dòng)員作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)許多中藥對(duì)于EPCs具有動(dòng)員作用，如黃芪、葛根素、丹參素等，補(bǔ)腎生血膠囊可通過動(dòng)員骨髓EPCs的遷移、分化，促進(jìn)局部血管新生，改善缺血組織供血[8]。

本研究結(jié)果表明，功血寧Ⅱ號(hào)組外周血EPCs數(shù)目在黃體各期均明顯增多，早期尤為顯著，表明具有滋腎調(diào)沖作用的功血寧Ⅱ號(hào)方能夠?qū)⒐撬柚械腅PCs動(dòng)員出來(lái)，增加外周血中的EPCs的數(shù)量。熒光顯微鏡下也觀察到，DAPI標(biāo)記的骨髓單個(gè)核細(xì)胞已從骨髓遷移進(jìn)入了外周血，并可見功血寧Ⅱ號(hào)組黃體早期數(shù)量為多，可與外周血中的EPCs的數(shù)目變化相印證。

滋腎調(diào)沖法的>確立是根據(jù)黃體功能不全性功血的月經(jīng)先期、經(jīng)前淋漓出血等臨床表現(xiàn)，認(rèn)為其發(fā)病主要責(zé)之于腎虛，導(dǎo)致沖脈失調(diào)。沖脈為“十二經(jīng)脈之?！?，又為血海而主月經(jīng)。而沖脈“注足少陰腎經(jīng)的大絡(luò)”，又與足少陰腎經(jīng)在腹部并行，只有腎精充盈，方能使太沖脈盛、血海盈滿，月事以時(shí)下，故有“經(jīng)本于腎，旺于沖任二脈”之說(shuō)。沖脈起始于胞宮，沖又有通之意，沖脈盛通，不僅可使月經(jīng)規(guī)律來(lái)潮，也有助于生殖功能，故腎精充沛，沖脈盛通，可促進(jìn)卵泡的發(fā)育、排卵及黃體功能的健全，而達(dá)到孕育的目的。功血寧Ⅱ號(hào)方以滋腎填精、養(yǎng)血柔肝、活血行氣之品組成，經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，該方具有促進(jìn)排卵和健全黃體功能的作用。本研究結(jié)果表明，功血寧Ⅱ號(hào)方能夠動(dòng)員骨髓EPCs至外周血中，提高循環(huán)血液中EPCs數(shù)量，對(duì)于EPCs進(jìn)一步遷移、歸巢至靶組織卵巢黃體，促進(jìn)黃體血管新生具有重要作用。

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