儲(chǔ) 毅 劉全華 華 麗 朱亞菊 高苗苗 鮑一笑

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒童呼吸科,上海200092)

人白介素13(hIL-13)是主要由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,在變態(tài)反應(yīng)性疾病特別是兒童哮喘的發(fā)病過程中具有核心介質(zhì)的作用[1]。IL-13 A2044G是位于人IL-13基因第四號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),即2044位堿基發(fā)生G到A突變,導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)多肽鏈第130位氨基酸由精氨酸(Arg,R)轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０?Gln,Q)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)IL-13 A2044G在兒童哮喘組與正常對(duì)照組間的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,為兒童哮喘發(fā)病的易感多態(tài)性位點(diǎn)[2]。為了利用哺乳細(xì)胞表達(dá)人 IL-13及其突變體,更進(jìn)一步地研究該多態(tài)性位點(diǎn)在功能方面對(duì)哮喘發(fā)病的影響,本實(shí)驗(yàn)室分別構(gòu)建了含有野生型IL-13和突變型IL-13基因的哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、載體、菌株、工具酶和試劑 質(zhì)粒pET28a-hIL-13(包含有人IL-13信號(hào)肽編碼序列和成熟IL-13編碼序列)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;Fetal brain cDNA,購于美國Stratagene公司;PfuI酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Angel DNA polymerase,購于美國 GenScript公司,內(nèi)含 10×Angel buffer和MgCl2(25 mmol/L);pcDNA3.1(+),購自美國Invitrogen公司;凝膠回收試劑盒購自上海捷倍思基因技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶HindⅢ(10 U/μl)、EcoR Ⅰ(10 U/μl)及 T4 DNA 連接酶(100 U/μl)購自 MBI Fermentas公司;堿性磷酸酶CIAP(20 U/μl)購自寶生生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒擴(kuò)增菌株E.coli DH5α購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;主要試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 hGH-hIL-13融合蛋白序列的設(shè)計(jì) 融合蛋白氨基酸序列如下:

①藍(lán)色字體為人生長激素蛋白序列(包含信號(hào)肽部分);②加陰影字體為人成熟IL-13的蛋白序列(不包含信號(hào)肽部分);③中間紅色加下劃線字體為TEV蛋白酶識(shí)別序列,此酶在識(shí)別序列的第6個(gè)氨基酸處(ENLYFQ↓G)切割蛋白。

1.3 引物設(shè)計(jì) 預(yù)采用融合PCR方法擴(kuò)增hGH-hIL13融合蛋白編碼序列,同時(shí)根據(jù)上述序列,設(shè)計(jì)引 物 如 下:hGH-F:5′-ATAAAGCTTGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCTG-3′;hGH-R:5′-GAAGCCACAGCTGCCCTCCACAGAGC-3;Linker-F:5′-GGCAGCTGTGGCTTCAGCGGCCACCACCACCACCACCACCACC ACGACTACGACATCCC-3′;Linker-IL13F:5′-CGACTACGACATCCCCTCCTCCGAGAACCTGTACTTCCAGGGACCTGTGCCTCCCTC-3′;IL13-a-R:ATAGAATTCAGTTGAACTGTCCCTCG ;IL13-g-R:ATAGAATTCAGTTGAACCGTCCCTCG。注:①hGH-F下劃線部分為HindⅢ的酶切位點(diǎn),IL13-a-R和IL13-g-R下劃線部分為EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)。②Linker-F 5′端和3′端下劃線部分分別為與hGH和hIL13互補(bǔ)的序列。

1.4 成熟人IL-13和IL-13m基因片段的擴(kuò)增 將pET28a-hIL-13稀釋 1 000倍作為模板,利用引物L(fēng)inker-IL13F和IL13-g-R擴(kuò)增野生型人IL-13基因片段,用引物L(fēng)inker-IL13F和突變引物 IL13-g-R擴(kuò)增突變型IL-13基因片段。反應(yīng)體系為 50 μl,依次加入 ddH2O 42.6 μl,10 ×Pfu buffer 5 μl,dNTP(25 mmol/L)0.4 μl,引物 (50 pmol/μl)各 0.5 μl,質(zhì)粒pET28a-hIL-13 0.5 μl,PfuI DNA Polymerase 0.5 μl 。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃5分鐘;95℃30秒,68℃(每個(gè)循環(huán)降0.5℃)45秒,72℃1分鐘,進(jìn)行21個(gè)循環(huán);然后95℃30秒,58℃45秒,72℃1分鐘,進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。配置2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。同時(shí)利用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.5 人生長激素編碼序列的擴(kuò)增 以人胎腦來源的人生長激素 cDNA為模板,利用引物hGH-F和hGH-R擴(kuò)增人生長激素編碼序列。反應(yīng)體系為50 μl,依次加入 ddH2O 40.3 μl,10 ×Angel buffer 5 μl,dNTP(25 mmol/l)0.4 μl,引物 (50 pmol/μl)各 0.5 μl,DMSO 2.5 μl,Fetal brain cDNA 0.5 μl,Angel DNA Polymerase 0.3 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃5分鐘;95℃30秒,68℃90秒,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);然后 72℃7分鐘。配置2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。同時(shí)利用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.6 融合PCR擴(kuò)增hGH-hIL13融合蛋白編碼序列以切膠純化產(chǎn)物,即 hIL-13和hGH目的基因,和Linker-F為模板,利用hGH-F和IL13-g-R擴(kuò)增含有野生型hIL-13的融合蛋白編碼序列,采用利用hGHF和IL13-a-R擴(kuò)增含有突變型 hIL-13的融合蛋白編碼序列。反應(yīng)體系為50 μl,依次加入 ddH2O 39.1 μl,10 ×Pfu buffer 5 μl,dNTP(25 mmol/l)0.4 μl,引物(50 pmol/μl)各 0.5 μl,hGH(膠回收產(chǎn)物)2 μl,Linker-F(2 pmol/μl)1 μl,IL-13(膠回收產(chǎn)物)1 μl,PfuI DNA Polymerase 0.5 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃5 分鐘;95℃30秒,68℃(每個(gè)循環(huán)降0.5℃)45秒,72℃1分鐘,進(jìn)行 21個(gè)循環(huán);然后 95℃30秒,58℃45秒,72℃1分鐘,進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。配置2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測,同時(shí)利用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.7 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)和已純化PCR產(chǎn)物,并用堿性磷酸酶處理載體,純化酶切產(chǎn)物。取 1 μl酶切后的PCR產(chǎn)物 ,3 μl已酶切的 pET-28a(+),0.5 μl 10×T4 DNA連接酶緩沖液,0.5 μl T4 DNA連接酶,16℃水浴過夜。取 5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μl感受菌E.coli DH5α,涂布 LB(Amp+)平皿,37℃倒置培養(yǎng)過夜,第二天觀察菌落生長情況。

1.8 質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定 從LB平皿中挑選單菌落,置于LB培養(yǎng)液(Amp+)內(nèi) 220 r/min 37℃過夜培養(yǎng),然后以菌液為模板,采用hGH-F和IL13-g-R或IL13-a-R引物進(jìn)行基因擴(kuò)增,以鑒定陽性克隆。純化含有目的基因的質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行DNA測序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),測序采用pcDNA3.1(+)載體正向(T7 promoter forward primer)和反向(BGH reverse primer)通用引物。

2 結(jié)果

2.1 成熟IL-13和IL-13m基因片段的擴(kuò)增 將質(zhì)粒pET28a-hIL-13稀釋1 000倍作為模板,用引物L(fēng)inker-IL13F和IL13-g-R擴(kuò)增野生型IL-13基因片段,用引物L(fēng)inker-IL13F和突變引物 IL13-g-R擴(kuò)增突變型IL-13基因片段。2%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示,在約386 bp的位置出現(xiàn)目的條帶,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致,如圖1所示。

2.2 人生長激素編碼序列的擴(kuò)增 以人胎腦來源的人生長激素cDNA為模板,利用引物hGH-F和hGH-R擴(kuò)增人生長激素編碼序列。用2%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物,結(jié)果顯示,在約 666 bp的位置出現(xiàn)目的條帶,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致,如圖1所示。

2.3 hGH-hIL13融合蛋白編碼序列特異性擴(kuò)增 以切膠純化產(chǎn)物,即hIL-13和hGH目的基因,和Linker-F為模板,利用 hGH-F和 IL13-g-R擴(kuò)增含有野生型 hIL-13的融合蛋白編碼序列,利用hGH-F和IL13-a-R擴(kuò)增含有突變型hIL-13的融合蛋白編碼序列。用2%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物,結(jié)果顯示,分別在約1 081 bp的位置出現(xiàn)目的條帶,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致,如圖1所示。

2.4 陽性克隆的鑒定 挑取已轉(zhuǎn)化菌株長出的單克隆菌落,接種到LB培養(yǎng)液(Amp+)中,37℃振蕩過夜培養(yǎng),用 hGH-F和 IL13-g-R或 IL13-a-R引物,以菌液為模板做PCR,2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果如圖2所示均在約1 081 bp位置有明顯條帶,故每個(gè)質(zhì)粒挑選的菌落均為陽性克隆。

2.5 pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-g測序結(jié)果 對(duì)陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提,采用pcDNA 3.1(+)載體正向(T7 promoterforwardprimer)和反向(BGH reverse primer)通用引物對(duì)其測序。兩質(zhì)粒測序結(jié)果,除了IL-13 A2044G多態(tài)性位點(diǎn)之外,基因序列完全一樣,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致,如圖3和圖4所示。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.1 Result of PCR product

圖2 陽性克隆鑒定電泳圖Fig.2 Testing result of positive clone

圖3 pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-a部分測序圖Fig.3 Sequencing result of pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-a

圖4 pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-g部分測序圖Fig.4 Sequencing result of pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-g

3 討論

hIL-13的基因定位于第 5號(hào)染色體長臂,即5q31,與編碼 IL-3、IL-4、IL-5和集落刺激因子 2的基因位于染色體同一區(qū)域,組成一個(gè)基因簇。rhIL-13的基因全長為4.6 kb,由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,其cDNA全長是 1.3 kb,含單一開放閱讀框架,編碼132個(gè)氨基酸殘基。切除20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽,人成熟IL-13為 112個(gè)氨基酸殘基,其主要以非糖基化的形式分泌。

文獻(xiàn)報(bào)道,IL-13誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)白三烯、表皮生長因子受體及鈣離子激活型氯離子通道蛋白,引起支氣管粘液過度分泌并損傷粘液纖毛的清除功能,導(dǎo)致支氣管阻塞[3-5]。2003年,Blackburn等人[6]報(bào)道,IL-13通過腺苷通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌趨化因子,招募單核細(xì)胞尤其是嗜酸性粒細(xì)胞聚集到支氣管,引起支氣管的慢性嗜酸性炎癥。IL-13通過下調(diào)支氣管平滑肌上β2腎上腺素能受體及影響支氣管粘膜上皮NO的合成等多重因素引起支氣管的高反應(yīng)性[7]。此外,IL-13還可刺激上皮細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子造成支氣管的重構(gòu)[8]。支氣管阻塞、嗜酸性炎癥、氣道高反應(yīng)性及其重構(gòu)是兒童哮喘的主要特征?？梢?IL-13是兒童哮喘發(fā)病的核心介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-13 A2044G和中國漢族兒童哮喘發(fā)病有明顯的關(guān)聯(lián),但這一研究結(jié)果僅限于統(tǒng)計(jì)學(xué)層面。為了在蛋白生物學(xué)水平上研究IL-13 A2044G多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)哮喘發(fā)病的影響,即IL-13 A2044G多態(tài)性是否會(huì)導(dǎo)致其蛋白生物學(xué)效應(yīng)改變,作用于上述細(xì)胞產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng),影響哮喘的發(fā)生發(fā)展,本實(shí)驗(yàn)室預(yù)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)兩種蛋白進(jìn)行重組表達(dá),故構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-g。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蛋白合成、加工和分泌的信號(hào)能夠準(zhǔn)確有效地識(shí)別,且哺乳細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有完善的再折疊結(jié)構(gòu),可對(duì)蛋白分子進(jìn)行糖基化,因此由哺乳細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白,在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng),更接近于天然結(jié)構(gòu)。

采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)外源蛋白進(jìn)行表達(dá),需要在外源蛋白編碼基因的5′端引入分泌性信號(hào)肽編碼序列,即在外源蛋白的N端加入分泌性信號(hào)肽部分,使外源蛋白分泌到細(xì)胞外,易于得到外源蛋白。同時(shí),在重組蛋白編碼基因的3′端引入組氨酸標(biāo)簽編碼序列,利于重組蛋白的純化。如果按照常規(guī)方法對(duì)hIL-13進(jìn)行表達(dá),需在 IL-13的N端引入分泌性信號(hào)肽部分,C端加上組氨酸標(biāo)簽,但I(xiàn)L-13 A2044G多態(tài)性位點(diǎn)靠近IL-13編碼基因的3′端,也就是靠近IL-13蛋白的C端。C端加入組氨酸標(biāo)簽可能會(huì)影響野生型及突變型hIL-13空間構(gòu)象的形成,對(duì)兩種蛋白的活性差別產(chǎn)生影響。hGH是人腦垂體前葉分泌的一種蛋白質(zhì)激素,由191個(gè)氨基酸殘基組成。其主要功能是促進(jìn)生長發(fā)育和維持組織器官的正常功能,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氨基酸吸收和促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。文獻(xiàn)報(bào)道,采用哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白時(shí),將人生長激素與目的蛋白融合表達(dá),可得到完整的目的蛋白[9,10]。此外,人生長激素的信號(hào)肽部分利于目的蛋白的分泌表達(dá)[11]。因此,構(gòu)建質(zhì)粒時(shí),hIL-13編碼基因上游引入了hGH編碼基因(包含信號(hào)肽部分),使hIL-13和hGH融合表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)采用融合PCR擴(kuò)增hGH-hIL13融合蛋白編碼基因,即通過引物設(shè)計(jì)使hGH、Linker-F和hIL13基因片段間形成一定長度的互補(bǔ)區(qū)域,且融合擴(kuò)增時(shí),PCR反應(yīng)體系中加入等摩爾數(shù)的hGH 、Linker-F和hIL13基因片段,最終得到融合蛋白編碼序列。融合PCR產(chǎn)物及pcDNA3.1(+)經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后,將hGH-hIL13融合蛋白編碼基因定向插入到載體pcDNA3.1(+)中,構(gòu)成質(zhì)粒,經(jīng)測序鑒定,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒:pcDNA3.1(+)/hGHIL13-a和 pcDNA3.1(+)/hGH-IL13-g,為后續(xù)野生型及突變型hIL-13經(jīng)哺乳細(xì)胞表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

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