黎佩怡 李粉霞 孫敏英 徐偉文 杜紅延 楊學(xué)習(xí)

(南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,廣州 510515)

乳腺癌是一個(gè)世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤,在女性惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率均居首位[1]。世界癌癥研究基金會(huì)調(diào)查數(shù)據(jù)表明,2008年全世界約有138萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌,45.8萬(wàn)婦女死于乳腺癌,目前,世界乳腺癌發(fā)病率仍呈不斷上升趨勢(shì)(http://globocan.iarc.fr/factsheets/cancers/breast.asp)。同時(shí),乳腺癌是中國(guó)婦女近年來(lái)增長(zhǎng)幅度最大的惡性腫瘤之一,其預(yù)防與控制將成為未來(lái)中國(guó)腫瘤控制計(jì)劃制定和實(shí)施的重點(diǎn)之一[2]。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展與許多基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)密切相關(guān),是一個(gè)復(fù)雜的多步驟的過(guò)程。遺傳因素與乳腺癌發(fā)生危險(xiǎn)顯著相關(guān),并可能加強(qiáng)其它危險(xiǎn)因素的致癌作用。

主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex,MHC)是位于脊椎動(dòng)物6號(hào)染色體上一組緊密連鎖的高度多態(tài)性的基因群,其基因產(chǎn)物不僅直接參與移植排斥反應(yīng)和T細(xì)胞的分化發(fā)育,并在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。人類的MHC又稱人類白細(xì)胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)基因,定位于人類6號(hào)染色體短臂的6p21.31區(qū),是首次發(fā)現(xiàn)與疾病有明確關(guān)系的抗原系統(tǒng)[3]。HLA多態(tài)性與多種疾病,特別是免疫系統(tǒng)疾病的易感性相關(guān)[4]。

TAP2基因?qū)儆贛HCⅡ類基因,位于HLA-DQB1和HLA-DPB1之間。研究發(fā)現(xiàn)TAP2基因SNP不僅與免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生相關(guān)[5-7],最近發(fā)現(xiàn)TAP2基因SNP與幾種腫瘤的易感性也是相關(guān)的[8-10]。但TAP2基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌之間的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道。本文就 TAP2兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(chr6-32897933和chr6-32914099)通過(guò)采用病例對(duì)照研究、ER陽(yáng)/陰性分組、PR陽(yáng)/陰性分組的設(shè)計(jì)方法,利用MassARRAY平臺(tái)IPLEX技術(shù)對(duì)中國(guó)漢族乳腺癌患者216例及健康對(duì)照組216人進(jìn)行檢測(cè),并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì),研究其多態(tài)性是否與乳腺癌相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 SNPs位點(diǎn)挑選 chr6-32897933為通過(guò)安捷倫靶向捕獲技術(shù)(Agilent SureSelect Target Enrichment System)在中國(guó)南方人群中新捕獲的位點(diǎn)。chr6-32914099在dbSNP中的編號(hào)為rs2071544。

1.2 樣本資料 研究對(duì)象分為乳腺癌病例組和健康對(duì)照組,均為漢族女性且相互間無(wú)血緣關(guān)系。其中乳腺癌病例組 216例,均為女性,平均年齡為47.62歲,中位年齡為47歲,來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院。健康對(duì)照組216例,均為女性,平均年齡為47.46歲,中位年齡47歲。為該院同期健康體檢人員,無(wú)乳腺癌病史,無(wú)乳腺癌家族史和其它腫瘤病史。

1.3 基因組DNA 樣本為外周血200 μ l。用DNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司,TIANamp Genomic DNA Kit)提取DNA(按說(shuō)明書(shū)操作),DNA保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) TAP2基因的目標(biāo)序列和所選擇的多態(tài)性位點(diǎn),利用Sequenom MassARRAY Assay Design 3.1軟件設(shè)計(jì)針對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)(chr6-32897933和chr6-32914099)的多重PCR特異性擴(kuò)增引物和延伸引物。設(shè)計(jì)結(jié)果如下所示:其中針對(duì)chr6-32897933特異性擴(kuò)增的引物為ACGTTGGATGTTCAGGATGAGGTGATGGAC和ACGTTGGATGTGGACTCACCCGAAGTATTG,單堿基延伸的引物為GTACTATTTGCCTCAATTTCC;針對(duì) chr6-32914099特異性擴(kuò)增的引物為ACGTTGGATGAATCCTTGTCCCTGCCCTC和ACGTTGGATGTTACTCAGGAGAGCTCTCAG,單堿基延伸的引物為GGAGAGCTCTCAGGGTTGAATAGGAT。

1.5 基因分型分析 提取純化后的基因組DNA樣品定量稀釋,按設(shè)計(jì)順序加樣于384孔板上,然后添加PCR擴(kuò)增體系使反應(yīng)物的終濃度如下:0.1 U的Taq聚合酶,5 ng基因組DNA,各2.5 pmol的PCR引物,2.5 mmol的dNTP。PCR反應(yīng)條件為:95℃15分鐘,然后45個(gè)循環(huán)的95℃20秒,56℃30秒,72℃30秒。剩余的dNTP經(jīng)添加0.3 U的堿性磷酸酶去除。單堿基延伸反應(yīng)通過(guò)添加5.4 pmol的各延伸引物,50 μ mol的 dNTP/ddNTP 混合物,0.5 U 的 Thermosequenase DNA聚合酶,反應(yīng)條件為94℃2分鐘,然后40個(gè)循環(huán)的94℃5秒,50℃5秒,72℃5秒。反應(yīng)產(chǎn)物用樹(shù)脂脫鹽20分鐘后經(jīng)自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于SpectroCHIP(Sequenom)芯片。點(diǎn)樣后的芯片用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SpectroREADER,Sequenom)檢測(cè)。此外對(duì)DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量控制,即保證基因分型成功率為95%以上。

1.6 數(shù)據(jù)分析 首先對(duì)病例組和對(duì)照組基因型分布頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,采用廣義遺傳模型,顯/隱性遺傳模型以及超顯性遺傳模型等對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì),采用Logisitic回歸消除年齡對(duì)統(tǒng)計(jì)的影響。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中病例組和對(duì)照組年齡不匹配,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.05,需要進(jìn)行年齡校正。chr6-32914099和chr6-32897933在對(duì)照和病例中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在隨后的病例/對(duì)照非條件Logistic回歸分析中,發(fā)現(xiàn)chr6-32914099位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有相關(guān)性;而chr6-32897933位點(diǎn)與乳腺癌的易感性相關(guān),相對(duì)于CC純合基因型,chr6-32897933位點(diǎn)TC基因型患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性增加。進(jìn)一步以ER和PR的陽(yáng)/陰性分組發(fā)現(xiàn),chr6-32914099在 ER陽(yáng)/陰性、PR陽(yáng)/陰性的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.51,P=0.029;OR=0.53,P=0.038),而 chr6-32897933 的基因型在ER陽(yáng)/陰性、PR陽(yáng)/陰性的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果情況如下:

2.1 SNP位點(diǎn)chr6-32914099多態(tài)性結(jié)果 chr6-32914099位點(diǎn)在漢族人群中存在TT、TC、CC多態(tài)性,各位點(diǎn)特征質(zhì)譜圖如圖1。TT、TC、CC多態(tài)性總分布頻率分別為13.89%、46.06%、40.05%。

2.1.1 chr6-32914099位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病率的相關(guān)性 chr6-32914099位點(diǎn)在病例對(duì)照分組中統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。其中TT、TC、CC各基因型在乳腺癌病例組的分布頻率為15.4%、43.8%、40.9%,在健康對(duì)照組的分布頻率為13.2%、50.7%、36.1%。經(jīng)過(guò)年齡校正后,在各種模型中,各個(gè)基因型沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異,表明該位點(diǎn)基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有相關(guān)性。

2.1.2 chr6-32914099位點(diǎn)多態(tài)性與ER陽(yáng)/陰性乳腺癌的相關(guān)性 chr6-32914099位點(diǎn)在ER陽(yáng)/陰性分組中統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。其中TT、TC、CC各基因型在ER陰性乳腺癌組的分布頻率為15.8%、52.6%、31.6%,在ER陽(yáng)性乳腺癌組的分布頻率為13.3%、39.0%、47.6%。經(jīng)過(guò)年齡校正后,在顯性模型中,基因型分布差異具有顯著性。即相對(duì)于C等位基因,具有T等位基因的TT和TC與乳腺癌ER狀態(tài)具有相關(guān)性。

2.1.3 chr6-32914099位點(diǎn)多態(tài)性與PR陽(yáng)/陰性乳腺癌的相關(guān)性 chr6-32914099位點(diǎn)在PR陽(yáng)/陰性分組中統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。其中TT、TC、CC各基因型在PR陰性乳腺癌組的分布頻率為66.7%,4.4%,28.9%,在PR陽(yáng)性乳腺癌組的分布頻率為61.4%,13.6%,25%。經(jīng)過(guò)年齡校正后,在超顯性模型中,基因型分布差異具有顯著性。即與TT和CC純合型相比,該位點(diǎn)基因的雜合型TC與乳腺癌PR狀態(tài)具有相關(guān)性。

圖1 chr6-32914099位點(diǎn)多態(tài)性TT、TC和 CC特征質(zhì)譜圖Fig.1 Schematic of the TT,TC and CC polymorphism ofchr6-32914099

表1 chr6-32914099位點(diǎn)多態(tài)性及其與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系Tab.1 Distribution of chr6-32914099 polymorphism in breast cancer and control groups

表2 chr6-32914099位點(diǎn)多態(tài)性及其與ER陽(yáng)/陰性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系Tab.2 Distribution of chr6-32914099 polymorphism in ER negative/positive breast cancer

表3 chr6-32914099位點(diǎn)多態(tài)性及其與PR陽(yáng)/陰性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系Tab.3 Distribution of chr6-32914099 polymorphism in PR negative/positive breast cancer

圖2 chr6-32897933位點(diǎn)多態(tài)性CC和CT特征質(zhì)譜圖Fig.2 Schematic of the CC and CT polymorphism of chr6-32897933

表4 chr6-32897933位點(diǎn)多態(tài)性及其與散發(fā)性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系Tab.4 Distribution of chr6-32897933 polymorphism in breast cancer and control group

2.2 SNP位點(diǎn)chr6-32897933多態(tài)性結(jié)果 chr6-32897933位點(diǎn)在漢族人群中存在CC和CT多態(tài)性,各位點(diǎn)特征質(zhì)譜圖如圖2。CC和CT多態(tài)性位點(diǎn)總分布頻率分別為97.45%和2.55%。

2.2.1 chr6-32897933位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病率的相關(guān)性 chr6-32897933位點(diǎn)在病例對(duì)照分組中統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。其中CC和CT各基因型在乳腺癌組的分布頻率為94.9%和5.1%,在健康對(duì)照組的分布頻率100%和0%。兩組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相對(duì)于CC純合基因型,攜帶CT雜合基因型者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。

2.2.2 chr6-32897933位點(diǎn)多態(tài)性與ER陽(yáng)/陰性乳腺癌的相關(guān)性 chr6-32897933位點(diǎn)在ER陽(yáng)/陰性分組中統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。其中CC和CT各基因型在ER陰性乳腺癌組的分布頻率為93.6%和6.4%,在ER陽(yáng)性乳腺癌組的分布頻率為95.4%和4.6%。兩組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3 chr6-32897933位點(diǎn)多態(tài)性與PR陽(yáng)/陰性乳腺癌的相關(guān)性 chr6-32897933位點(diǎn)在PR陽(yáng)/陰性分組中統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表6。其中CC和CT各基因型在PR陰性乳腺癌組的分布頻率為95.8%和4.2%,在PR陽(yáng)性乳腺癌組的分布頻率為93.4%和6.6%。兩組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 chr6-32897933位點(diǎn)多態(tài)性及其與ER陽(yáng)/陰性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系Tab.5 Distribution of chr6-32897933 polymorphism in ERnegative-positive breast cancer

表6 chr6-32897933位點(diǎn)多態(tài)性及其與PR陽(yáng)/陰性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系Tab.6 Distribution of chr6-32897933 polymorphism in PRnegative-positive breast cancer

3 討論

目前通過(guò)定位克隆和全基因關(guān)聯(lián)分析已確定了多個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)的乳腺癌易感基因。盡管如此,人們至今仍然沒(méi)有能在MHC區(qū)域發(fā)現(xiàn)十分肯定的乳腺癌易感基因或位點(diǎn)。但已有研究表明,在腫瘤中,HLAⅠ類分子由正常組織的陽(yáng)性表達(dá)轉(zhuǎn)為減弱或消失[11],HLAⅡ類分子則由陰性表達(dá)轉(zhuǎn)為陽(yáng)性表達(dá)。HLA抗原的缺失可能意味乳腺癌細(xì)胞的增殖發(fā)展。這種抗原提呈與處理的缺失不斷積累,最終可能導(dǎo)致腫瘤特異T細(xì)胞減少對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別[12,13]。TAP2為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)超家族的成員之一,編碼一種膜蛋白,參與HLAⅠ類分子的抗原提呈[14]。TAP表達(dá)下調(diào)與乳腺癌發(fā)展相關(guān),意味著TAP的缺失與腫瘤細(xì)胞的免疫逃避有關(guān)[15],研究發(fā)現(xiàn)HLAⅡ類分子和Ⅲ類分子的多態(tài)性都與乳腺癌易感性相關(guān)[16,17],但尚無(wú)TAP多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)216例廣東漢族乳腺癌患者及216人健康對(duì)照組的 TAP2中兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)chr6-32914099和chr6-32897933的基因分型,發(fā)現(xiàn)TAP2多態(tài)性位點(diǎn)chr6-32914099與廣東漢族女性乳腺癌的易感性無(wú)關(guān),而chr6-32897933位點(diǎn)TC基因型攜帶者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性增加。該結(jié)果暗示TAP2基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用,但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

早在一個(gè)世紀(jì)之前,學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳腺癌與類固醇激素中的雌激素有關(guān)[18]。隨后很快又發(fā)現(xiàn)與孕激素也有關(guān)系。雌激素和孕激素分別通過(guò)雌激素受體(Estrogen receptor,ER)和孕激素受體(Progesterone receptor,PR)對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。ER或PR的狀態(tài)明顯影響乳腺癌的病理進(jìn)程、預(yù)后以及激素治療效果。臨床上可以通過(guò)對(duì)ER和PR的檢測(cè),得出腫瘤細(xì)胞內(nèi)激素受體含量的水平,從而提示乳腺癌的預(yù)后信息和指導(dǎo)內(nèi)分泌治療。而HLA基因型分布又和ER或PR陰陽(yáng)性密切相關(guān)[19,20]。對(duì)于中國(guó)人群,宋三泰[21]早在1989年就報(bào)道HLA與ER的相關(guān)性。本次研究發(fā)現(xiàn)chr6-32914099雖與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān),卻與患者 ER和 PR狀態(tài)相關(guān);chr6-32897933位點(diǎn)與廣東漢族女性乳腺癌的易感性有關(guān),卻與ER和PR狀態(tài)無(wú)關(guān)。但TAP2與乳腺癌及其ER和PR狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性尚需多地區(qū)、大樣本人群的驗(yàn)證。

探索TAP2基因多態(tài)性與散發(fā)性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,不僅有助于揭示TAP2在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制,也為乳腺癌的個(gè)體化醫(yī)療提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究探索了TAP中兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)chr6-32914099和chr6-32897933與廣東漢族人群中散發(fā)性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果顯示多態(tài)性位點(diǎn)chr6-32914099與廣東漢族女性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān),而chr6-32897933與廣東漢族女性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān),相對(duì)于CC基因型,TC基因型攜帶者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性增加。

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