李永偉 何志強(qiáng) 楊 恒 張小倩 王春霞 裴東旭 (河南省中醫(yī)院檢驗科,鄭州450002)

病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是一種可由多種病毒感染引起的臨床心血管系統(tǒng)感染性疾病。近年來,無論國際上還是在我國病毒性心肌炎的發(fā)病率呈上升趨勢,嚴(yán)重威脅著兒童和青少年的健康,并且是青少年猝死的主要原因之一。更甚者部分病人病毒持續(xù)感染最終可導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病,其預(yù)后不良,病死率較高[1]。然而至目前為止,其確切的機(jī)制尚不完全清楚,目前認(rèn)為可能的機(jī)制有兩種:大量的病毒感染對心肌的直接損傷和進(jìn)行性自身免疫損傷,且大量數(shù)據(jù)表明在病毒性心肌炎病程中后期免疫損傷顯得尤為重要。

樹突狀細(xì)胞(DCs)作為專職的抗原提呈細(xì)胞(APC),其提呈抗原能力是巨噬細(xì)胞和 B細(xì)胞的10～100倍,是唯一能活化靜息期T淋巴細(xì)胞、刺激幼稚細(xì)胞增殖,并建立初級免疫反應(yīng)的APC。大量研究表明DCs在病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用[2,3],而以往研究多是基于動物模型,具體在人體如何鮮見報道。因此本文以臨床VMC外周血單核細(xì)胞來源的DCs為研究對象,和正常人相比較探討DCs功能狀態(tài)的變化,為VMC的臨床研究和治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病人資料 篩選2010年3月至2011年2月河南省中醫(yī)院住院和門診病毒性心肌炎患者16例,均符合1999年9月在昆明召開的《全國小兒心肌炎、心肌病學(xué)術(shù)會議》上討論并修訂的《病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》(修訂草案)[4]?；颊呓?jīng)常規(guī)檢查排除風(fēng)濕性,中毒性和細(xì)菌性等非病毒性心肌炎。18例VMC患者中男性11例,女性7例。年齡最小15歲,最大36歲,平均21.5歲。20例健康志愿者為健康體檢者和本科室人員,且均為體檢完全健康人員。其中男性11人,女性9人,最小18歲,最大35歲,平均23.5歲。

1.2 材料 RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、絲裂霉素C、優(yōu)質(zhì)新生牛血清購自GIBCO公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板均為 Corning公司產(chǎn)品;rhGM-CSF、rhIL-4、LPS、CCK-8試劑盒、FITC-Dextran顆粒和人淋巴細(xì)胞分離液均購自上海吉泰生物科技公司;FITC標(biāo)記人CD1a、CD14、CD83和 PE 標(biāo)記人CD80、CD86、MHC-Ⅱ等單克隆抗體均為Bio-rad公司產(chǎn)品;人TNF alpha ELISA Ready-SET-Go(88～7 346)和 IL-12p70 ELISA Ready-SET-Go(88～7 126)試劑盒均為eBiosence公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 PBMC分離和DCs誘導(dǎo) 用肝素抗凝管收集健康志愿者、病毒性心肌炎患者外周血10 ml,PBS以1∶1稀釋,混勻,沿管壁輕緩移入放有等體積Ficoll-泛影葡胺(人淋巴細(xì)胞分離液)離心管,20℃500 r/min離心20分鐘,吸取分層液的白膜層,PBS洗滌2次,6 ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基(10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)重懸后種于90 mm培養(yǎng)皿中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱3小時,吸去非貼壁細(xì)胞并收集貼壁細(xì)胞,重懸計數(shù)后以含有rhGM-CSF(1 000 U/ml)和 rhIL-4(800 U/ml)的 RPMI 1640完全培養(yǎng)基調(diào)濃度至1×105個/ml,然后以每孔2 ml接種于24孔板,放置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于第3天、第5天半量換液,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)7天后收集細(xì)胞。陽性對照孔于第6天加入LPS(1μg/ml)刺激培養(yǎng)24小時。

1.3.2 表面分子分析 分別收集兩組誘導(dǎo)前后4×105個細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌兩次后重懸于100μl含有0.1%BSA的PBS中,分別加入FITC標(biāo)記人 CD1α、CD14、CD83 和 PE 標(biāo)記的抗人 CD80、CD86和MHC-Ⅱ特異性單克隆抗體,使終濃度為5 μg/ml?；靹蚝?℃避光靜置30分鐘。然后預(yù)冷PBS洗滌兩次后重懸于300μl PBS。應(yīng)用BD公司的FACSCalibur檢測,CellQuest軟件分析表面分子變化。同時平行染同型對照。

1.3.3 吞噬能力分析 按每孔3×105個細(xì)胞分別接種于兩塊24孔培養(yǎng)板中,每組細(xì)胞分別接種兩孔。在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時后加入FITC標(biāo)記Dextran顆粒,使該顆粒終濃度為1 g/L,放一塊24孔板于4℃,作為吞噬實驗對照,另一塊24孔板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1小時。分別收集兩塊板上不同組DCs,以4℃下24孔板中細(xì)胞作為非特異性吸附對照調(diào)整陰性群,以FITC的平均熒光強(qiáng)度代表吞噬量,于流式細(xì)胞儀分析各組DCs吞噬功能。

1.3.4 單向混合淋巴細(xì)胞試驗 抽取健康志愿者外周血20 ml,按2.2.1介紹方法無菌分離PBMC,尼龍毛柱法獲得T淋巴細(xì)胞,用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)濃度至1×106個/ml備用;分別收集不同誘導(dǎo)組的DCs,用50μg/L的絲裂霉素37℃處理30分種,應(yīng)用不完全RPMI1640培養(yǎng)基洗滌兩遍,計數(shù)后用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)濃度至1×106個/ml備用;分別取不同組DCs和T淋巴細(xì)胞(注:T淋巴細(xì)胞和DCs來源非同一志愿者),按1∶4的比例接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)液總體積200μl。每組平行重復(fù)3孔,同時設(shè)未加DCs組作為對照。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測淋巴細(xì)胞增殖情況。

1.3.5 ELISA測定培養(yǎng)上清細(xì)胞因子 把第3、5、7天收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清按照eBiosence公司生產(chǎn)的人TNF alpha ELISA Ready-SET-Go(88～7 346)和IL-12p70 ELISA Ready-SET-Go(88～7 126)試劑盒使用說明,對上述細(xì)胞因子進(jìn)行定量測定。

2 結(jié)果

2.1 DCs誘導(dǎo)前后CD14和CD1α表達(dá)分析 為評價單核細(xì)胞分離和DCs誘導(dǎo)效果,分別在誘導(dǎo)前后應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析單核細(xì)胞表面標(biāo)志CD14和人DCs表面標(biāo)志CD1α表達(dá)情況。結(jié)果如圖1所示:在第0天,以表達(dá)CD14細(xì)胞群為主;誘導(dǎo)后,在第7天以表達(dá)CD1α的細(xì)胞群為主。證實無論單核細(xì)胞分離或是DCs誘導(dǎo)均達(dá)到實驗要求。

2.2 DCs誘導(dǎo)前后CD83的變化 誘導(dǎo)前分別流式分析志愿者來源的和VMC患者來源的單核細(xì)胞,結(jié)果不表達(dá)CD83;誘導(dǎo)7天后再次分析各組中表達(dá)CD83的細(xì)胞比例,結(jié)果為:自愿者組平均(4.35±0.86)%,n=5;VMC患者組平均(29.06±6.18)%,n=4;LPS對照組(單核細(xì)胞來源于志愿者)平均(61.37±9.05)%,n=5(結(jié)果如圖2所示)。

2.3 VMC患者組來源的DCs表達(dá)較高水平的CD80、CD86和MHCⅡ 分別收集誘導(dǎo)7天后各組的DCs,應(yīng)用PE標(biāo)記 CD80、CD86和MHCⅡ的單克隆抗體染色后應(yīng)用流式分析。結(jié)果如圖3所示:與志愿者組相比較,VMC患者外周血單核細(xì)胞來源的DCs表達(dá)CD80、CD86和MHCⅡ明顯上調(diào),尤其CD86和MHCⅡ表達(dá)均上調(diào)一倍以上,與LPS誘導(dǎo)成熟對照相一致。該實驗平行重復(fù)三次,結(jié)果趨勢一致。

圖1 DCs誘導(dǎo)前后 CD14,CD1α的表達(dá)變化Fig.1 Thedifferent expression of CD14 and CD1αon Mo-Dcs before and after induction

圖2 誘導(dǎo)前后CD83的表達(dá)Fig.2 The expression of CD83 on Mo-Dcs before and after induction

圖3 三組DCs表達(dá)CD80,CD86和MHCⅡ的情況Fig.3 The expression of CD80,CD86 and major histocompatibility complex-II on threedifferent Mo-DCs

圖4 流式細(xì)胞儀分析三組DCs吞噬能力Fig.4 The phagocytosis of threegroup DCs analyzed by FACS

2.4 VMC患者組來源的DCs吞噬能力下降 與2.2和2.3中結(jié)果對應(yīng),VMC患者組來源的DCs處于較成熟的功能狀態(tài),其吞噬能力下降。如(圖4)所示:以FITC標(biāo)記Dextran為吞噬顆粒,以4℃的DCs作為非特異性吸附背景,37℃的細(xì)胞熒光強(qiáng)度代表吞噬能力。結(jié)果與LPS陽性對照組相一致,VMC患者組來源的DCs與志愿者組DCs相比較,吞噬能力明顯下降。

圖5 T淋巴細(xì)胞增殖分析(±s,n=4)Fig.5 The analysis of T lymphocytes proliferation(±s,n=4)

圖6 DCs誘導(dǎo)過程中細(xì)胞因子TNF-α和 IL-12的變化Fig.6 Time course of TNF-αand IL-12 secretion during DC differentiation

2.5 VMC患者來源的DCs更能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖 采用單向混合淋巴反應(yīng)檢測不同組DCs對T淋巴的刺激能力。共培養(yǎng)四天后混合體系中加入CCK-8溶液,2小時后酶標(biāo)儀上450 nm處檢測吸光度值。以減去空白孔吸光度值做為最終結(jié)果,且平行做四個副孔。結(jié)果如(圖5)顯示與志愿者組相比較,來源于VMC患者的DCs可以更有效的刺激T淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.05)。

2.6 DCs誘導(dǎo)過程中TNF-α和IL-12的分泌情況 在誘導(dǎo)的第三天就可以檢測到細(xì)胞因子IL-12在志愿者組和VMC中表達(dá)無明顯差異;但是在志愿者組中第三天未檢測出TNF-α分泌,而患者組為0.45 ng/ml。在第5天和第七天兩種細(xì)胞因子在各組均可檢測到,TNF-α在患者組和志愿者組間存在明顯差異(P＜0.01),IL-12p70在兩組中表達(dá)同樣差異顯著。結(jié)果如(圖6)所示。

3 討論

病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是指由嗜心肌病毒感染引起的以心肌非特異性間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤為主要表現(xiàn)的心肌炎癥性疾病。臨床從心肌局灶炎癥無癥狀到心肌彌漫性炎癥所致的重癥心肌炎均可見,發(fā)病機(jī)制早期表現(xiàn)為病毒復(fù)制的直接損傷,在發(fā)生發(fā)展過程中以細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷為主[5],且促炎因子和抗炎因子的平衡失調(diào)是免疫心肌損傷的重要原因之一,可見在VMC中免疫調(diào)節(jié)平衡與否是影響疾病發(fā)展和愈后的關(guān)鍵,而免疫反應(yīng)的中心就是樹突狀細(xì)胞(DC)。

因而,本研究以確診病毒性心肌炎患者外周血Mo-DCs為研究對象,發(fā)現(xiàn)和健康人相比較,來源于病毒性心肌炎患者外周血Mo-DCs,無論從細(xì)胞表型、吞噬能力、刺激活性還是細(xì)胞因子分泌,都顯示其表現(xiàn)出近似成熟DCs所具備的功能狀態(tài)。它與LPS刺激成熟組Mo-DCs表現(xiàn)相一致。既往研究表明外周血單核細(xì)胞通過GM-CSF加IL-4所誘導(dǎo)的DCs大多為未成熟DC(iDC),而我們發(fā)現(xiàn)無論是DCs成熟標(biāo)志CD83(圖 2)還是 CD86、CD80、MHC Ⅱ(圖 3),在 VM 患者的Mo-DCs上都不同程度的表達(dá)上調(diào)[6],且分泌較高水平的炎性細(xì)胞因子IL-12(d7:0.27±0.02 ng/ml)和 TNF-α(d7:2.60±0.95 ng/ml)(圖6)。

在機(jī)體受病原體侵害時,首先發(fā)生的是固有免疫應(yīng)答,如單核/巨噬細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞,NK細(xì)胞等通過模式識別受體(Pattern-recognition receptors,PRR)識別病原相關(guān)模式分子(Pathogen associated molecular patterns,PAMP)對細(xì)菌、病毒等進(jìn)行清除[7]。如果病原體未能完全清除,就會進(jìn)一步激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。病毒性心肌炎患者中病毒感染同樣如此。而DCs就是連接兩大免疫的橋梁和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的中心[8]。在VMC發(fā)病的過程中,固有免疫應(yīng)答中單核/巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞通過TLR7、TLR8、TLR9等識別病毒核酸成分進(jìn)而活化[9],活化后的單核/巨噬細(xì)胞可以分泌多種促炎因子如TNF-α、IL-1、IL-6等這些均可以促使DCs成熟。這可能是VMC患者的Mo-DCs處于較成熟狀態(tài)的原因之一。這點也與在誘導(dǎo)第三天時就在患者組Mo-DCs培養(yǎng)上清中檢測到較高水平TNF-α(圖6)相一致。此外,TNF-α激活巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用的同時也直接參與了心肌細(xì)胞炎性損傷的病理生理過程,其可以誘導(dǎo)上調(diào)心肌細(xì)胞表面TNFR1表達(dá),并與之結(jié)合誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[10]。固有免疫中DCs同樣可以識別病毒的核酸成分而活化成熟,處于成熟狀態(tài)的DCs又可以直接調(diào)節(jié)固有免疫功能比如促使NK細(xì)胞活化,使其更好地發(fā)揮免疫效應(yīng)[11];VMC患者來源的Mo-DCs表達(dá)較高水平的IL-12,而IL-12同樣是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵因子,它可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生更多的IFN-γ,同時提高這些細(xì)胞的溶細(xì)胞活性;此外IL-12可以促使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化并上調(diào)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[12]。以往研究表明無論是細(xì)胞因子 TNF-α、IL-12、IFN-γ等,還是CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞等都在病毒性心肌炎中扮演重要角色[13]。

綜上所述,相較于健康人,病毒性心肌炎患者外周血Mo-DCs處于較成熟的功能狀態(tài):高表達(dá)的CD80、CD83、CD86和MHCⅡ使其更有效的刺激活化特異性免疫細(xì)胞,使其活化增殖發(fā)揮特異性免疫應(yīng)答;分泌高水平的 IL-12、TNF-α等炎性細(xì)胞因子,不僅促使Th1細(xì)胞,NK細(xì)胞發(fā)揮功能,同時TNF-α也可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡?？梢娫谌瞬《拘孕募⊙字蠨Cs直接和間接地參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。這些都為臨床研究和新治療方法的應(yīng)用提供思路。然而本課題僅就人外周血Mo-DCs進(jìn)行了初步研究,至于在人心肌組織局部DCs功能狀態(tài)和其它細(xì)胞如何相互作用都需要進(jìn)一步研究證實。

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