李 珍，羅玉鳳，曹金伶，郭春嵐，王鴻琳，肖鏡璉，張 潔，張 丁

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1口腔科 2病理科，北京100730

·論著·

免疫蛋白酶體亞基在干燥綜合征唇腺中的表達

李 珍1，羅玉鳳2，曹金伶2，郭春嵐1，王鴻琳1，肖鏡璉1，張 潔1，張 丁1

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院1口腔科2病理科，北京100730

目的觀察免疫蛋白酶體亞基人低分子質(zhì)量多肽(LMP) 2、LMP7在干燥綜合征(pSS)患者唇腺中的表達情況, 探討其在pSS診斷、鑒別診斷和發(fā)病機制中的作用。方法收集40例pSS患者、15例非pSS的結(jié)締組織病患者和9例正常人的下唇唇腺組織標本，通過免疫組織化學(xué)方法, 觀察LMP2和LMP7在3組唇腺組織中的表達情況; 計算腺泡陽性率，半定量分析LMP2和LMP7在各組唇腺組織中的表達強度。對數(shù)據(jù)進行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后，采用單因素方差分析比較3組間的LMP2和LMP7的腺泡陽性率差異，用Spearman進行pSS組的腺泡陽性率與各臨床檢查結(jié)果的相關(guān)性分析。結(jié)果LMP2和LMP7表達在腺泡細胞和導(dǎo)管上皮細胞。LMP2的腺泡陽性率3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.369)，LMP7的腺泡陽性率3組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，pSS組高于結(jié)締組織病組，結(jié)締組織病組高于正常組；僅pSS組內(nèi)的LMP7的腺泡陽性率高于LMP2(P<0.01)。pSS組內(nèi)LMP2和LMP7腺泡陽性率與臨床各檢驗結(jié)果無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論pSS患者唇腺中LMP7的表達明顯增強，LMP2無明顯上調(diào)，提示LMP7和LMP2兩亞基的個體基因調(diào)節(jié)機制不同。

干燥綜合征；蛋白酶體；涎腺

干燥綜合征(primary Sj?gren’s syndrome，pSS) 又稱原發(fā)性舍格倫綜合征，是一種自身免疫介導(dǎo)的慢性炎性疾病，以外分泌腺，尤其是唾液腺和淚腺的進行性破壞為特點。其主要病理變化發(fā)生在腺實質(zhì)細胞和胞外基質(zhì)中，致使腺泡萎縮、導(dǎo)管破壞，造成腺體功能紊亂，出現(xiàn)口、眼干燥等癥狀和體征[1]。蛋白酶體普遍存在于真核細胞胞漿內(nèi)。蛋白酶體亞基在pSS患者體內(nèi)表達發(fā)生變化，最初的證據(jù)是在pSS患者血清中分離出蛋白酶體α和β亞基的自身抗體[2]。雖然自身抗體的存在并不一定意味著靶抗原在病變過程中受累及，但可以代表一個附屬表征，循環(huán)蛋白酶體成分的出現(xiàn)可能是細胞破壞和自身免疫病中免疫活性的標志[3]。近年研究顯示pSS患者唇腺組織內(nèi)免疫蛋白酶體β亞基中人低分子質(zhì)量多肽(low molecular weight polypeptide、LMP)2、復(fù)合催化蛋白酶樣蛋白1(multicatalytic endopeptidase complex-like 1、MECL-1)和LMP7的mRNA表達上調(diào)[4-6]。但在蛋白水平上，組織學(xué)和血清中均顯示LMP2表達下調(diào)[5,7]，LMP7表達有爭議(無差異[5]或特異性上調(diào)[6])，因而學(xué)者提出蛋白酶體在pSS患者體內(nèi)可能表達失調(diào)。蛋白酶體途徑的失調(diào)和異常是促使惡性腫瘤、退行性、代謝性和自身免疫性疾病形成的發(fā)病機制。本研究擬通過免疫組織化學(xué)方法觀察LMP2、LMP7在pSS患者、有口干癥狀的非干燥綜合征的結(jié)締組織病患者和正常人唇腺組織中的表達情況，探討其在疾病診斷、鑒別診斷及發(fā)生機制中的作用。

對象和方法

對象全部患者均為就診于北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科及口腔科門診或住院患者，自2010年1至6月于北京協(xié)和醫(yī)院口腔科門診接受唇腺活檢。pSS組40例，其中女性38例、男性2例，平均年齡(46±11)歲，診斷均符合2002年pSS國際分類(診斷)標準[8]；非pSS的結(jié)締組織病(connective tissue disease, CTD)組15例，其中女性14例、男性1例，平均年齡(49±14)歲，包括類風濕關(guān)節(jié)炎7例、系統(tǒng)性紅斑狼瘡4例、原發(fā)性膽汁性肝硬化3例；正常組9例，來源于唇外傷(6例)或唇黏液腺囊腫(3例)周圍正常的唇腺組織，其中女性5例、男性4例，平均年齡(49±20)歲。

免疫組織化學(xué)方法將64例石蠟包埋的唇腺切片脫蠟、梯度復(fù)水后，進行高壓法抗原修復(fù)，用Bio-mol公司的兔抗人LMP2和LMP7親合純化多克隆抗體(BML-PW8345和BML-PW8355，1∶1 000的稀釋度)，顯色劑選用Dako公司的K3468，采用Envision兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒進行免疫組織化學(xué)染色。覆蓋切片的病理號及分組信息(原始編碼)，重新進行隨機編碼(二次編碼)，在每張切片上隨機選取100個腺泡，設(shè)定腺泡腔面棕色顆粒沉積面積超過腺泡腔、細胞膜總面積50%者為陽性腺泡，重復(fù)讀數(shù)4次，取平均值，計算每張切片的腺泡陽性率。待獲得所有讀片結(jié)果后，再對照二次編碼和原始編碼，對LMP2和LMP7蛋白的表達進行分組分析，從而對pSS組、CTD組和正常組唇腺總蛋白中LMP2和LMP7的表達水平進行半定量分析。并根據(jù)2002年pSS分類(診斷)標準(根據(jù)每4 mm2涎腺組織中有多于50個淋巴細胞的聚集記為一個灶，制定分級標準：0級：無淋巴細胞浸潤；Ⅰ級：輕度浸潤；Ⅱ級：中度浸潤；Ⅲ級：一個灶；Ⅳ級：一個灶以上。病理改變?yōu)棰蠡颌艏墑t為陽性)[8]將pSS組、CTD組和正常組的唇腺進行淋巴細胞灶性分級。

統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)(腺泡陽性率)先進行平方根反正弦轉(zhuǎn)換，得正態(tài)分布數(shù)據(jù)后，應(yīng)用單因素方差分析比較正常、CTD和pSS 3組的LMP2和LMP7抗體的腺泡陽性率差異，再通過LSD和Tamhane法進行兩兩比較。采用配對t檢驗比較各組內(nèi)的兩種抗體之間的腺泡陽性率差異。用Spearman相關(guān)分析pSS組的腺泡陽性率與各臨床檢查結(jié)果的相關(guān)程度。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

HE染色結(jié)果正常、CTD和pSS 3組患者的唇腺組織進行淋巴細胞灶性分級結(jié)果顯示，正常和CTD組的淋巴細胞灶性分級均不超過Ⅱ級，而pSS組中有38例均超過Ⅲ級(表1)。

免疫組織化學(xué)結(jié)果及定位將各唇腺切片LMP2和LMP7染色后的腺泡陽性率數(shù)據(jù)進行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后，得正態(tài)分布，再用單因素方差分析3組間LMP2、LMP7的陽性率差異(表2)，結(jié)果顯示3組間LMP2的腺泡陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.369)，LMP7的腺泡陽性率pSS組高于CTD組，CTD組高于正常組 (P<0.01)。再運用配對樣本t檢驗在3組內(nèi)分別對LMP2和LMP7染色后的腺泡陽性率進行比較，結(jié)果顯示僅pSS組內(nèi)的LMP7的腺泡陽性率高于LMP2(T=-7.948，P<0.01)。

LMP2和LMP7在唇腺組織中的表達免疫組織化學(xué)染色可見正常組在LMP2和LMP7染色后，僅腺泡細胞胞漿輕度著色，腺泡和導(dǎo)管細胞胞核少數(shù)著色；CTD組染色后，顯示腺泡細胞胞漿著色較正常組稍深，部分腺泡細胞胞核著色，導(dǎo)管細胞少量著色；pSS組染色后，LMP2在部分腺泡細胞胞核和胞膜上有分布，侵潤的淋巴細胞著色稍明顯；LMP7染色后可見除腺泡細胞胞漿著色明顯外，大部分胞核和胞膜著色，侵潤的淋巴細胞著色明顯，導(dǎo)管細胞大部分著色(圖1)。

LMP2、LMP7的表達與臨床表現(xiàn)間的相關(guān)性pSS患者的唇腺切片LMP2和LMP7腺泡陽性率(經(jīng)平方根反正弦變換后)與抗SSA抗體、抗SSB抗體和抗核抗體(三者經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后)、淚液分泌試驗、淋巴細胞灶性分級、非刺激唾液流率和血清IgG的結(jié)果無相關(guān)性(P>0.05)(表3)。

討 論

蛋白酶體是具有多相催化活性的蛋白酶復(fù)合體。在生物進化過程中，這種酶體表現(xiàn)出高度保守性, 它存在于所有真核細胞的胞漿及胞核中，無論在正常人還是干燥綜合征患者的唇腺腺泡中均有分布，維持著細胞內(nèi)的動態(tài)平衡[9]，本研究也驗證了這個結(jié)果。26S蛋白酶體由20S核心復(fù)合物和兩個19S調(diào)節(jié)復(fù)合物組成，多亞基和多催化中心的20S核心由7種α亞基和10種β亞基組成，其蛋白水解活性定位于β1、β2、β5亞基上，在促炎癥因子干擾素-γ的誘導(dǎo)下，上述3個亞基可分別為有催化活性的β1i(LMP2)、β2i(MECL -1)和β5i(LMP7)亞基所替代, 形成具有活性的免疫蛋白酶體， 負責降解各種胞漿蛋白成為肽段，供T淋巴細胞識別[10]。蛋白酶體除在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、細胞生長周期、分化、凋亡等細胞生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，還控制應(yīng)激和免疫反應(yīng)。此外，蛋白酶體還在主要組織相容性復(fù)合物I類分子的抗原提呈、免疫應(yīng)答和許多自身免疫病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[11]。LMP2和LMP7同為免疫蛋白酶體兩個重要的蛋白水解亞單位，本研究pSS患者、CTD和正常人唇腺組織中的表達不同。

表 1 3組受試者唇腺的淋巴細胞灶性分級(n) Table 1 Lymphocytes focus-scores in the labial glands of three groups (n)

CTD：結(jié)締組織??；pSS：干燥綜合征

CTD：connective tissue disease；pSS：primary Sj?gren’s syndrome

表 2 3組唇腺切片的LMP2和LMP7腺泡陽性率

LMP：低分子質(zhì)量多肽

LMP: low molecular weight polypeptide

表 3 pSS組LMP2和LMP7腺泡陽性率與臨床的相關(guān)性

本研究免疫組織化學(xué)檢測顯示LMP7在pSS組唇腺組織中表達明顯上調(diào)，相比較CTD組和正常組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。主要分布在大多數(shù)的腺泡細胞和導(dǎo)管細胞的腔面和胞核上，侵潤的淋巴細胞也有明顯著色。近年研究顯示在唇腺組織學(xué)上LMP7的mRNA表達水平，pSS組較CTD組或正常組內(nèi)顯著上調(diào)[5-6]。免疫蛋白酶體3個亞基的免疫組織化學(xué)比較顯示LMP7表達增高，在導(dǎo)管細胞和腺泡細胞強表達[6]，這與本研究結(jié)果一致。但Morawietz 等[5]提取了17例pSS患者和11例非自身免疫病患者的唇腺組織進行免疫蛋白酶體3個亞基的免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示LMP7表達在pSS組唇腺組織中有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]到該研究的樣本量有限(僅28例并包括治療中患者)，且免疫組織化學(xué)結(jié)果讀取采用分級法，可能與本研究64例樣本，通過讀數(shù)腺泡陽性率半定量檢測LMP7的表達有差異。

本研究LMP2的組織學(xué)表達pSS組、CTD組和正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究通過基因芯片分析顯示人LMP2/β型蛋白酶體9和β型蛋白酶體10/MECL-1均位列pSS與正常人唇腺組織中的最差異基因排行前50位，提出LMP2、MECL-1在pSS患者唇腺內(nèi)mRNA表達上調(diào)[4]。Morawietz 等[5]也在組織學(xué)上用RT-PCR法證實了上述觀點，但通過免疫印跡法顯示LMP2的蛋白表達水平明顯下調(diào)。從外周血免疫蛋白酶體亞基的分析來看，在mRNA水平上，LMP2、MECL-1在pSS患者血單核細胞中明顯上調(diào)，但在蛋白水平上LMP2在pSS組中明顯下調(diào)[7]。本研究顯示pSS患者唇腺內(nèi)LMP2表達較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻報道是一致的，這種現(xiàn)象說明LMP2在pSS體內(nèi)是表達失調(diào)的。LMP2蛋白表達失調(diào)可能由于LMP2 mRNA轉(zhuǎn)錄后缺陷、翻譯過程障礙或LMP2蛋白穩(wěn)定性降低引起，導(dǎo)致腺實質(zhì)細胞中LMP2抗原性的改變，不能用現(xiàn)有的技術(shù)檢出組織中的LMP2，具體過程有待蛋白學(xué)上進一步的研究。蛋白酶體系統(tǒng)對于T細胞的發(fā)育和主要組織相容性復(fù)合物 I類分子的抗原提呈非常重要。目前尚無研究證實LMP2的蛋白表達失調(diào)導(dǎo)致pSS患者體內(nèi)免疫蛋白酶體數(shù)量分布變化，但是pSS體內(nèi)抗原提呈細胞的主要組織相容性復(fù)合物 I類分子結(jié)合的肽在數(shù)量和質(zhì)量上均會有所改變，可能會促進自身免疫發(fā)病機制。

pSS唇腺內(nèi)侵潤的淋巴細胞上LMP7著色明顯，由于侵潤的淋巴細胞大部分是T細胞，干擾素-γ又是浸潤性T細胞所產(chǎn)生，在其誘導(dǎo)下促使有活性的LMP2、MECL-1和LMP7生成并組成了免疫蛋白酶體。可見局部炎癥促進免疫蛋白酶體功能亢進、加工抗原、促進提呈；引起胞內(nèi)受損蛋白甚至正常蛋白的大量降解，進而導(dǎo)致細胞損傷。本研究結(jié)果提示，pSS患者LMP2和LMP7在腺泡細胞和導(dǎo)管細胞腔面的分布與唇腺中的淋巴細胞浸潤灶評分無相關(guān)性，因為LMP7除了在浸潤的淋巴細胞中，還在腺泡細胞和導(dǎo)管上皮細胞中高表達，因此與單獨的淋巴細胞灶性分級可能無關(guān)。此外，目前尚不清楚這些蛋白酶體亞基是否是從炎性唾液腺組織釋出的。

本研究pSS患者唇腺切片中LMP2和LMP7腺泡陽性率與臨床檢驗結(jié)果顯示：與抗SSA抗體、抗SSB抗體和抗核抗體、淚液分泌試驗、淋巴細胞灶性分級、非刺激唾液流率和血清IgG均無相關(guān)性，其具體原因尚待進一步研究。

文獻報道MECL-1需要LMP2的輔助才能有效地合并為蛋白酶體前體，而包含LMP2和MECL的蛋白酶體前體需要LMP7才能高效的成熟，組成免疫蛋白酶體[12]。本研究組織學(xué)顯示pSS患者LMP7在腺泡細胞和導(dǎo)管細胞腔面的分布明顯增多，LMP2的分布無明顯改變，提示LMP7和LMP2兩亞基的個體基因調(diào)節(jié)機制不同。建議下階段可從基因和分子生物學(xué)水平對pSS的蛋白酶體系統(tǒng)進行研究，進一步理解蛋白酶體各亞基在致病機制中的意義及三亞基之間的關(guān)系，在組織學(xué)或細胞學(xué)上鑒別pSS特異性標記物，為pSS的早期診斷提出新的敏感指標和治療方案。

(本文圖1見插圖第2頁)

[1] Salomonsson S, Rozell BL, Heimburger M, et al. Minor salivary gland immunohistology in the diagnosis of primary Sj?gren’s syndrome[J]. J Oral Pathol Med, 2009, 38(3):282-288.

[2] Feist E, Kuckelkorn U, D?rner T, et al. Autoantibodies in primary Sj?gren’s syndrome are directed against proteasomal subunits of the alpha and beta type[J]. Arthritis Rheum, 1999, 42(4):697-702.

[3] Egerer K, Kuckelkorn U, Rudolph PE, et al. Circulating proteasomes are markers of cell damage and immunologic activity in autoimmune diseases[J]. J Rheumatol, 2002, 29(10):2045-2052.

[4] Hjelmervik TO, Petersen K, Jonassen I, et al. Gene expression profiling of minor salivary glands clearly distinguishes primary Sj?gren’s syndrome patients from healthy control subjects[J]. Arthritis Rheum, 2005, 52(5):1534-1544.

[5] Morawietz L, Martinez-Gamboa L, Scheffler S, et al. Expression of proteasomal immunosubunit beta1i is dysregulated in inflammatory infiltrates of minor salivary glands in Sj?gren’s syndrome[J]. J Rheumatol, 2009, 36(12):2694-2703.

[6] Egerer T, Martinez-Gamboa L, Dankof A, et al. Tissue-specific up-regulation of the proteasome subunit beta5i (LMP7) in Sj?gren’s syndrome[J]. Arthritis Rheum, 2006, 54(5):1501-1508.

[7] Krause S, Kuckelkorn U, D?rner T, et al. Immunoproteasome subunit LMP2 expression is deregulated in Sj?gren’s syndrome but not in other autoimmune disorders[J]. Ann Rheum Dis, 2006, 65(8):1021-1027.

[8] Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, et al. Classification criteria for Sj?gren’s syndrome: a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group[J]. Ann Rheum Dis, 2002, 61(6):554-558.

[9] Scheffler S, Kuckelkorn U, Egerer K, et al. Autoimmune reactivity against the 20S-proteasome includes immunosubunits LMP2 (b1i), MECL1 (b2i) and LMP7 (b5i) [J]. Rheumatology, 2008, 47(5):622-626.

[10] Unno M, Mizushima T, Morimoto Y, et al. The structure of the mammalian 20S proteasome at 2.75 A resolution[J]. Structure, 2002, 10(5):609-618.

[11] Goldberg AL, Cascio P, Saric T, et al. The importance of the proteasome and subsequent proteolytic steps in the generation of antigenic peptides[J]. Mol Immunol, 2002, 39(3-4):147-164.

[12] Griffin TA, Nandi D, Cruz M, et al. Immunoproteasome assembly: cooperative incorporation of interferon gamma (IFN-gamma)-inducible subunits[J]. J Exp Med, 1998, 187(1):97-104.

ExpressionofProteasomeImmunosubunitinLabialGlandsofPatientswithPrimarySj?gren’sSyndrome

LI Zhen1, LUO Yu-feng2, CAO Jin-ling2，GUO Chun-lan1, WANG Hong-lin1,XIAO Jing-lian1, ZHANG Jie1, ZHANG Ding1

1Department of Stomatology,2Department of Pathology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

ZHANG Ding Tel: 010-65296339, E-mail:dingz77@sina.com

ObjectiveTo investigate the expression of proteasome immunosubunit low molecular weight polypeptide (LMP)2 and LMP7 in labial glands of patients with primary Sj?gren’s syndrome patients, and thus explore their role in the diagnosis, differential diagnosis and pathogenesis of primary Sj?gren’s syndrome (pSS).MethodsLabial specimens were collected from 40 patients with pSS, 15patients with connective tissue diseases other than pSS, and 9 healthy controls. The expressions of LMP2 and LMP7 in labial specimens were determined using immunohistochemical approaches and analyzed using semi-quantitative methods. The positive rate of acinar was calculated. After the square arcsine transformation of data, the differences of the positive rate in acinar between LMP2 and LMP7 were compared among three groups. Spearman’s rank correlation coefficient was used for analyzing the correlation of clinical manifestations with LMP2 and LMP7 expressions.ResultsThe expressions of LMP2 and LMP7 within the acinar and ductal epithelial cells were confirmed. Although the LMP2 expression in labial specimens was not significantly different among three groups(P=0.369), the expression of LMP7 was significantly higher in pSS patients compared with patients with connective tissue disease and healthy controls (P<0.01). Only in pSS group, LMP7 was found to be with higher positive rate in acinar than LMP2 (P<0.01). No significant correlation was found between LMP2/LMP7 and clinical manifestations (P>0.05).ConclusionIn patients with pSS, the expression of LMP7 (but not LMP2) is up-regulated in labial gland, indicating these two proteins have different genetic regulation mechanisms.

primary Sj?gren’s syndrome; proteasome; salivary glands

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：146-150

張 丁 電話：010-65296339，電子郵件:dingz77@sina.com

R781

A

1000-503X(2011)02-0146-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.010

2010-10-29)