張菊紅,李南方,嚴(yán)治濤，姚曉光，王紅梅，張德蓮，王新玲

新疆自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓科 新疆高血壓診斷治療研究中心，烏魯木齊 830001

·論著·

原發(fā)性高血壓患者G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白-2基因的測序分析

張菊紅,李南方,嚴(yán)治濤，姚曉光，王紅梅，張德蓮，王新玲

新疆自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓科 新疆高血壓診斷治療研究中心，烏魯木齊 830001

目的在新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓患者中進行測序分析，尋找新的G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白-2基因序列變異。方法選擇新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓患者94例，抽取靜脈血提取DNA。采用PCR產(chǎn)物直接測序法，對94例樣本的外顯子區(qū)及其側(cè)翼序列進行測序，檢測G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白-2基因變異情況。結(jié)果94例樣本共檢測出13個變異位點，包括5個常見變異和8個新發(fā)現(xiàn)變異位點，其中啟動子區(qū)變異7個,內(nèi)含子2個,外顯子1和外顯子5各檢出1個新的錯義突變(K18N和Y178C)；-638A>G、-395G>C、1891-1892TC I/D和 2971G>C 以及-43A>T 和 2297A>G 之間存在連鎖不平衡關(guān)系(r2≥0.8)。結(jié)論RGS2基因在新疆哈薩克族高血壓患者中檢出的變異位點及頻率存在種族特異性，外顯子區(qū)的錯義突變頻率較低，是否影響血壓調(diào)節(jié)需進一步的功能驗證。

G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白-2；原發(fā)性高血壓；單核苷酸多態(tài)性；錯義突變；哈薩克族

G蛋白家族是心血管細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理活動必需的重要分子，G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)了體內(nèi)許多神經(jīng)遞質(zhì)和激素生物學(xué)功能，對于血管收縮、心輸出量及血流量具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白-2(regulator of G-protein signaling 2, RGS2)是一種選擇性的高效作用于G蛋白q亞基的抑制劑, 介導(dǎo)血管尤其是阻力血管的收縮與舒張[2]。敲除了RGS2基因的小鼠表現(xiàn)出頑固的高血壓表型和持續(xù)地阻力血管收縮[3-4]。研究顯示RGS2基因的一些錯義突變改變了蛋白質(zhì)功能從而影響了實驗動物的血壓水平[5]。世界不同人群中均發(fā)現(xiàn)了各民族特異的錯義突變位點，其中部分位點已在動物實驗中證明與高血壓表型相關(guān)[6-7]。目前復(fù)雜疾病的關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)的易感位點僅發(fā)揮較小疾病表型作用(相對危險度為1.1～1.5 倍)，有研究者提出未被發(fā)現(xiàn)的遺傳度可能存在于低頻率變異或罕見突變，這些變異可能具有更高的表型效應(yīng)[8-9]。盡管DNA測序的費用在很大程度上降低了，但是在全基因組范圍內(nèi)，對大規(guī)模原發(fā)性高血壓人群進行測序?qū)ふ倚碌牡皖l率單核苷酸多態(tài)性和罕見突變?nèi)匀贿b不可及。因此，本研究選擇94例具有原發(fā)性高血壓表型的樣本，對感興趣的DNA區(qū)域直接進行測序分析。

對象和方法

對象選取2007至2008年新疆阜康地區(qū)高血壓流行病學(xué)調(diào)查的哈薩克族原發(fā)性高血壓患者94例, 男女各47例，年齡39～60歲，平均(49.45±5.23)歲。94例高血壓患者體重指數(shù)為(29.01±3.8)kg/m2，血清總膽固醇水平為(4.68±1.13) mmol/L, 血清三酰甘油為(1.27±0.65) mmol/L，血清高密度脂蛋白為(0.95±0.27) mmol/L, 收縮壓水平為(159.56±16.99)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，平均舒張壓水平為(99.89±8.54)mmHg。

基因組DNA的提取采用PAXgene血DNA提取試劑盒 (Franklin Lakes，NJ,USA)提取人血白細(xì)胞DNA，配制成濃度為50 ng/μl的液體，制備成96孔板，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

RGS2基因測序從美國國家生物信息庫獲得RGS2基因組及外顯子序列， 引物3軟件設(shè)計7對引物(表1)。對94例原發(fā)性高血壓患者RGS2基因的所有外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列進行擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括10×緩沖液 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μl，Taq酶0.3 μl，50 ng DNA模板1 μl，去離子水18.2 μl。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 15 min；變性94℃ 45 s：退火65℃ 45 s，每個循環(huán)退火溫度下降0.5℃，延伸72℃ 60 s(前12個循環(huán))；變性94℃ 45 s；退火59℃ 45 s，延伸72℃ 60 s(后30個循環(huán))；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化處理后，用BigDye熒光染料(ABI公司，美國)及單向引物對PCR產(chǎn)物進行測序PCR擴增，測序PCR產(chǎn)物經(jīng)磁珠法純化用ABI 3100XL基因分析儀(ABI公司,美國)進行PCR產(chǎn)物測序。

表 1 PCR測序引物

連鎖不平衡分析采用SNPAlyze, version 7.0 Pro軟件 (DYNACOM Co. Ltd., Mobara, Japan) 計算各個位點之間的連鎖不平衡關(guān)系，r2≥0.8為存在連鎖不平衡關(guān)系。

結(jié) 果

序列分析結(jié)果94例樣本PCR產(chǎn)物直接測序，啟動子區(qū)分別成功擴增91例和88例，外顯子區(qū)均成功擴增93例。采用序列分析軟件發(fā)現(xiàn)13個變異位點， 5個常見變異(最小等位基因頻率>5%)：包括啟動子區(qū)的-638A>G(rs2746071)、-395G>C(rs2746072)和-43A>T(rs12130714)，內(nèi)含子3區(qū)的1891-1892TC(rs3053226)和內(nèi)含子4區(qū)2297A>G(rs17647363)；8個新發(fā)現(xiàn)變異位點：啟動子區(qū)的-629G>A、-578G>T、-549T>G、-638A>G、-395 G>C和-218C>G， 3’-UTR區(qū)的 2889A>T和2971 G>C(表2)。

連鎖不平衡分析-638A>G、-395G>C、1891-1892TC I/D和 2971G>C 存在連鎖不平衡(r2=0.8)；-43A>T和2297A>G之間完全連鎖(r2=1)。

錯義突變在外顯子1發(fā)現(xiàn)1例K18N的純合突變，導(dǎo)致RGS2蛋白第18個氨基酸由賴氨酸變?yōu)樘於彼?；在外顯子5發(fā)現(xiàn)1例Y178C的雜合突變，導(dǎo)致RGS2蛋白第178個氨基酸由絡(luò)氨酸變?yōu)榘腚装彼?，圖1為突變位點的測序片段。在美國國家生物信息庫數(shù)據(jù)庫查找K18N和Y178C突變位點在其他種系的氨基酸序列進行比對，兩個突變位點及其側(cè)翼氨基酸序列具有較強的保守性。

討 論

RGS2基因長約3233bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，位于1q31～1q32區(qū)域。RGS2超蛋白家族中20多個成員都有一個共同的高度保守的RGS結(jié)構(gòu)域，約含有130個氨基酸，為雙親性的α螺旋結(jié)構(gòu)，G蛋白α亞基通過與RGS結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮作用。日本高血壓人群測序發(fā)現(xiàn)5個錯義突變(Q2L、 Q2R、M5V、R44H和 Q78H)和1個框移突變(1925-1926insT)，其中Q2L、Q2R、M5V和R44H均發(fā)生在α螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域[9]。隨后，Bodenstein 等[10]在功能實驗中驗證了Q2L和R44H能夠引起RGS2蛋白功能的改變。Steven等[5]研究表明R44能夠穩(wěn)定脂質(zhì)雙分子層與RGS2的α螺旋結(jié)構(gòu)域的連接，含有R44H突變的人類RGS2蛋白對G蛋白q亞基信號通路的抑制作用明顯減弱，導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。美國128例白人及122例黑人發(fā)現(xiàn)了2個錯義突變Q50K和2138-2139in/delAA(rs10607546)，其中僅存在于黑人人群中Q50K的發(fā)生在α螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，是否影響蛋白質(zhì)功能尚未明確，而常見框移突變2138-2139in/delAA病例對照研究表明和美國黑人的高血壓相關(guān)[7]。

表 2 94例高血壓患者G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白-2基因測序樣本變異位點情況

G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白-2的DNA序列計數(shù)以起始密碼子ATG的A作為1，參考序列來自GenBank (NT_004671)；a、b：表示具有連鎖關(guān)系的變異位點，定義為r2≥0.8

The A of the ATG of the initiator methionine codon is denoted nucleotide 1, the nucleotide sequence (GenBank accession ID: NT_004671) was used as a reference sequence; a,b: the apparent linkage disequilibrium, defined by r-square more than 0.8, was indicated by a,b in the linkage disequilibrium column

本研究未發(fā)現(xiàn)其他已報道人群的錯義突變，但發(fā)現(xiàn)兩個新的錯義突變K18N和Y178C,其中K18N位于α螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，突變頻率為0.1%，該位點是否能夠改變蛋白功能并引起高血壓表型有待進一步驗證。3個人群中發(fā)現(xiàn)的錯義突變均為各人群首次檢測出并為各自特有。以上均提示RGS2基因變異具有明顯的種族差異性，尤其是發(fā)生在蛋白編碼區(qū)的錯義突變，不同民族都具有特異的突變位點。至于其他常見變異及內(nèi)含子區(qū)的變異在不同種族均有發(fā)現(xiàn)，但存在頻率差異。在日本935例高血壓患者中對RGS2的外顯子及側(cè)翼序列測序，發(fā)現(xiàn)39個變異位點[6]；本研究與之相同的變異位點有6個(-638A>G、-395G>C、-43A>T、1891-1892delTC 和2297A>G)；在美國人群中(128例白人、122例黑人)發(fā)現(xiàn)變異位點13個(含一個錯義突變Q50K[7],與本研究相同的變異位點有3個(-43A>T 、2297A>G和 1891-1892delTC)，在哈薩克人及日本人群中2297A>G和-43A>T均存在連鎖不平衡關(guān)系[6]，提示亞洲人群具有更相似的遺傳變異。共有的3個變異位點在本研究人群、日本人群，美國白人和黑人的最小等位基因頻率有明顯差異(-43A>T：8.1%、4.2%、17.5%和4.8%；2297A>G：8.1%、4.4%、19.2%和4.1%；1891-1892delTC:28.5%、40.6%、22.1%和24.8%)，-43A>T和2297A>G在美國白人具有更高的變異頻率，而1891-1892delTC在亞洲人有更高的頻率[6-7]。

本研究尚存在局限性，即未在相同民族的正常血壓人群中進行測序分析，如僅對存在于病例組的錯義突變進行功能驗證。總之，已有的功能實驗及人群研究均提示RGS2是血壓調(diào)節(jié)重要蛋白之一，其功能區(qū)的突變對原發(fā)性高血壓的遺傳學(xué)病因研究具有重要意義，本研究的兩個錯義突變是否影響蛋白功能及血壓調(diào)節(jié)將在進一步的研究中驗證。

[1] De Vries L, Zheng B, Fischer T, et al. The regulator of G protein signaling family[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2000, 40(2):235-271.

[2] Tang M, Wang G, Lu P, et al. Regulator of G-protein signaling-2 mediates vascular smooth muscle relaxation and blood pressure[J]. Nat Med, 2003, 9(4):1506-1512.

[3] Heximer SP, Knutsen RH, Sun XG, et al. Hypertension and prolonged vasoconstrictor signaling in RGS2-deficient mice[J]. J Clin Invest, 2003, 111(7):445-452.

[4] Ross DF, Gyros R. Regulator of G-protein signaling-2 as a candidate gene: the road to hypertension or just another roadside marker[J].Hypertension, 2006, 47(6):337-338.

[5] Steven Gu, Sam Tirgari S, Heximer SP. The RGS2 gene product from a candidate hypertension allele shows decreased plasma membrane association and inhibition of Gq [J]. Pharmacol, 2008, 73(9):1037-1043.

[6] Yang J, Kamide K, Kokubo Y, et al. Genetic variations of regulator of G-protein signaling 2 in hypertensive patients in the general population[J]. J Hypertens,2005, 23(7):1497-1505.

[7] Evan L, Brinda KR, Kenton KM, et al. Polymorphisms and haplotypes of the regulator of G protein signaling-2 gene[J]. Hypertension, 2006, 47(5):415-420.

[8] Cohen JC, Kiss RS, Pertsemlidis A, et al. Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol [J]. Science, 2004, 305(5685):869-872.

[9] Ng SB, Turner EH, Robertson PD, et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exons [J]. Nature, 2009, 461(7261):272-276.

[10] Bodenstein J, Sunahara RK, Neubing RR. N-terminal residues control proteasomal degradation of RGS2, RGS4 and RGS5 in human embryonic kidney cell[J]. MOL Pharmacol, 2007, 71(2):1040-1050.

DetectionofGeneticVariationsofRegulatorofG-proteinSignaling2inHypertensivesbySequencing

ZHANG Ju-hong, LI Nan-fang, YAN Zhi-tao, YAO Xiao-guang,WANG Hong-mei, ZHANG De-lian, WANG Xin-ling

Department of Hypertension, Xinjiang People’s Hospital, Center of Diagnosis, Treatment and Research of Hypertension in Xinjiang，Urumqi 830001,China

LI Nan-fang Tel:0991-8564818，E-mail:lnanfang2009@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the new genetic variations of regulator of G-protein signalling 2 (RGS2) gene in Kazakh hypertensives.MethodsTotally 94 Kazakh patients with essential hypertension were enrolled and genomic DNA was extracted from their peripheral blood leukocytes. All the exon regions and their flanking sequences ofRGS2 were directly sequenced.ResultsWe identified 13 variants including 5 common- single nucleotide polymorphisms with a minor allele frequency over 5%single nucleotide polymorphisms and 8 novel variations in 94 Kazakh hypertensives. Among these variations, 2 were in the introns and 7 in the promoter region. One subject had a G-to-C substitution at nucleotide 54 in exon 1, which lead to an amino acid substitution from K-to-N at position 18; another individual had an A-to-G substitution at nucleotide 2422 in exon 5, resulting in an amino acid from Y-to-C at position 178. Among eight common single nucleotide polymorphisms, -638A>G, -395G>C, 1891-1892TC I/D, and 2971G>C,and -43A>T and 2297A>G were in tight linkage disequilibrium with an r-square of more than 0.8, respectively.ConclusionsThe variants and their frequencies inRGS2 gene in Kazakh hypertensives may have ethnic differences when compared with other populations. The frequencies of the mutations are low in this population, and whether they influence blood pressure regulation requires further functional experiments.

regulator of G-protein signaling 2; essential hypertension; single nucleotide polymorphisms; missense mutation; Kazakh

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：200-204

李南方 電話：0991-8564818，電子郵件: lnanfang2009@hotmail.com

R3.3

A

1000-503X(2011)02-0200-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.020

2010-04-23)