秦 麗, 張惠華, 郭淑軍, 段飛蝶, 陳友鵬， 梁旭競， 陳小佳△

(1暨南大學(xué)生物工程研究所,基因工程藥物國家工程研究中心,廣東省生物工程藥物重點實驗室； 2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，廣東 廣州 510632)

外源性EGR1瞬時表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響*

秦 麗1, 張惠華1, 郭淑軍1, 段飛蝶1, 陳友鵬2， 梁旭競2， 陳小佳1△

(1暨南大學(xué)生物工程研究所,基因工程藥物國家工程研究中心,廣東省生物工程藥物重點實驗室；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，廣東 廣州 510632)

目的獲得人早期生長反應(yīng)1(EGR1)基因，并在人骨肉瘤細(xì)胞中瞬時表達(dá)，研究該基因在人骨肉瘤細(xì)胞中的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法以人胎盤組織為模板，巢式PCR(nest PCR)擴(kuò)增獲得EGR1全長基因，克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)，酶切、PCR鑒定并測序正確后，命名為pcDNA-EGR1。脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞U2OS，實時熒光定量PCR(qPCR)和免疫印跡檢測目的基因的表達(dá)； MTT法檢測細(xì)胞生長和增殖情況；流式細(xì)胞儀和DAPI染色檢測細(xì)胞的周期變化和凋亡情況；qPCR檢測細(xì)胞中與細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化情況；短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾EGR1后，檢測細(xì)胞的變化情況。結(jié)果成功獲得了人EGR1基因并構(gòu)建了其重組表達(dá)載體pcDNA-EGR1。EGR1可有效地在U2OS中瞬時表達(dá)；可顯著抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)，并呈一定的劑量依賴。EGR1可引起細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，并促進(jìn)凋亡率增加(P<0.05)。EGR1可引起細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的固縮和凋亡表型。EGR1可引起周期相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，凋亡相關(guān)基因表達(dá)則顯著上調(diào)。shRNA干擾EGR1后，細(xì)胞凋亡表型和EGR1所調(diào)控的相關(guān)基因表達(dá)水平與對照組一致。結(jié)論EGR1具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖作用，能調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期停滯和凋亡率的增加。

基因,早期生長反應(yīng)； 瞬時表達(dá)； 骨肉瘤細(xì)胞； 生長抑制

早期生長反應(yīng)1(early growth response 1, EGR1)蛋白是一個重要的核轉(zhuǎn)錄因子，又稱為神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)蛋白1(nerve growth factor-induced protein A,NGFI-A)、鋅指蛋白268(zinc finger protein 268，Zif268)、鋅指蛋白225(zinc finger protein 225,Zif225)和Krox-24蛋白。其基因EGR1為早期生長反應(yīng)基因家族(EGR family)重要成員，編碼59 kD的核磷蛋白，最早被發(fā)現(xiàn)是因其能被絲裂原和分化因子誘導(dǎo)[1]，無外界刺激時，EGR1在大多數(shù)組織中表達(dá)量都很低。EGR1含有1個高度保守的DNA結(jié)合域，該結(jié)合域由3個鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成，它能與富含GC的序列GCGC(G/T)GGGCG結(jié)合[2]；同時EGR1含有1個核定位信號，2個激活域和1個抑制域，有利于其調(diào)控目的基因的表達(dá)[3]。

EGR1在不同細(xì)胞類型或刺激下，有多方面作用，包括分化、生長、生長抑制和凋亡，它可結(jié)合到目的基因DNA上起到激活轉(zhuǎn)錄作用[4]。有研究表明[5]，EGR1 能逆轉(zhuǎn)HT1080 纖維肉瘤細(xì)胞、ZR27521乳腺癌等細(xì)胞的惡性表型，并抑制這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)化性生長和在裸鼠體內(nèi)的致瘤性；郝淼旺等[6]也報道外源表達(dá)EGR1對某些肝癌及食管癌細(xì)胞生長具有抑制作用。然而，在前列腺癌等一些癌癥中，EGR1表達(dá)卻是上調(diào)的，這表明它具有原癌性。相繼有報道指出，EGR1具有促進(jìn)前列腺癌進(jìn)行的作用[7]。這表明EGR1并不是一個純粹的腫瘤抑制子，而是具有腫瘤抑制和促進(jìn)雙重生物學(xué)作用。鑒于此，將其作為一個安全的癌治療靶標(biāo)之前，必須對其作用全面了解，并深入研究相關(guān)機(jī)制。

EGR1的抑癌機(jī)制在乳腺癌、卵巢癌等癌癥中研究較多[4]，而在人骨肉瘤U2OS中的生物學(xué)功能尚未見深入報道[8]，本文構(gòu)建真核表達(dá)載體將EGR1轉(zhuǎn)入U2OS中，采用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]、FCM(流式細(xì)胞術(shù),flow cytometry,又名FACS)、DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚,4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色、qPCR(實時熒光定量PCR,real-time quantitative PCR)和RNAi(RNA干擾，RNA interference)實驗等方法檢測EGR1對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡等方面的影響，為進(jìn)一步研究EGR1在骨肉瘤中的抑癌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 DH5α菌株和pcDNA 3.1(-)質(zhì)粒均購自日本TaKaRa公司；U2OS細(xì)胞購自美國ATCC。

1.2主要試劑 Trizol試劑、SYBR green real-time PCR mix和MTT分別購自Invitrogen、Toyobo和Sigma；ECL發(fā)光液和逆轉(zhuǎn)錄酶MLV分別購自Pierce和Promega；內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ購自NEB;Primer Star和T4 ligase購自TaKaRa;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒及無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒購買于Omega;LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen;細(xì)胞周期和凋亡檢測試劑購自碧云天;抗體購自CST。

1.3引物的設(shè)計和合成 根據(jù)GenBank(NM_001964.2)收錄的EGR1 cDNA全長序列,利用生物軟件Primer Primer 5.0設(shè)計巢式PCR特異性引物, 外側(cè)引物序列如下：上游引物5′-ACACCAGCTCTCCAGCCTGCTCGTC-3′,下游引物5′-CTCCTCCTGTCCTTTAAGTCTCTTG-3′，擴(kuò)增長度1 727 bp；內(nèi)側(cè):上游引物5′-ATGCGAATTCGCTAGCGCCGCCACCATGGCCGCGGCCAAGGCCGAGAT-3′(含EcoRⅠ酶切位點和Kozak序列),下游引物5′-ATGCAAGCTTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGT-AGCAAATTTCAATTGTCCT-3′(含HindⅢ酶切位點和HA標(biāo)簽)，擴(kuò)增長度1 697 bp。

根據(jù)GenBank(NM_001964.2)收錄的EGR1 cDNA全長序列，由上海吉瑪公司設(shè)計合成的EGR1 shRNA序列為EGR-1(601):正義鏈5′-r(CAACGAGAAGGUGCUGGU G)d(TT)-3′，反義鏈5′-r(CACCAGCACCUUCUCGUUG)d(TT)-3′，此序列克隆入PGPU6/GFP/Neo載體，命名為sh601。

2方法

2.1模板制備 取冷凍的人胎盤組織，加入適量的Trizol，酚仿法提取組織RNA，經(jīng)RT-PCR得到cDNA。

2.2構(gòu)建EGR1真核表達(dá)載體 采用巢式PCR擴(kuò)增EGR1全長cDNA，按PrimerStar PCR系統(tǒng)說明書操作。擴(kuò)增產(chǎn)物回收、純化后進(jìn)行EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切，產(chǎn)物純化后，與同樣處理的pcDNA3.1(-)載體連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α，涂板，37 ℃，培養(yǎng)15 h，挑取單客隆，于LB-AMP+中擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PCR擴(kuò)增目的序列2種方法鑒定，獲得的重組子命名為pcDNA-EGR1。

2.3脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞U2OS 對數(shù)生長期的U2OS細(xì)胞計數(shù)后，按1×106cells/well，種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度為70%時，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。以轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-EGR1(以下簡稱pEGR1)和shRNA(以下簡稱pEGR1+sh601)為實驗組，轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1(-)空載(以下簡稱pV)為對照組，按每孔4μg DNA(shRNA∶DNA =4∶1)，用5μL LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后，收集細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)染步驟按LipofectamineTM2000試劑操作說明。

2.4qPCR和Western blotting檢測目的基因表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，用適量Trizol裂解細(xì)胞，酚仿法抽提RNA。設(shè)計跨內(nèi)含子引物，qPCR檢測目的基因表達(dá)情況。引物序列如下：EGR1-正義鏈5′-GCAGCAGCAGCACCTTCAAC-3′，EGR1-反義鏈5′-TCTCGTT GTTCAGAGAGATG-3′。

轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細(xì)胞，收集裂解液，蛋白定量，12%SDS-PAGE電泳分離，進(jìn)行常規(guī)的Western blotting實驗。

2.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞后的MTT法分析 對數(shù)生長期的U2OS細(xì)胞計數(shù)后，按1×104cells/well，種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度為70%時，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。設(shè)計pV組、分別以50 ng/well、133 ng/well、250 ng/well轉(zhuǎn)染pEGR1質(zhì)粒的過表達(dá)組，按每孔0.25 μL LipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后，棄培養(yǎng)基，加MTT液50 μL培養(yǎng)4 h。甩干孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加100 μL異丙醇振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測各孔A值(檢測波長570 nm，參考波長630 nm)。計算細(xì)胞的增殖率=各EGR1過表達(dá)組平均A/對照組(pV組)平均A×100%。

2.6流式細(xì)胞儀和DAPI染色檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后U2OS細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡 按2.3方法，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，常規(guī)固定處理，PI染色， 篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞周期分析。按2.3方法，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，常規(guī)固定處理，DAPI染色20 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核狀態(tài)。

2.7qPCR檢測EGR1過表達(dá)和shRNA干擾EGR1后U2OS細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá) 按2.3方法，得到cDNA后，qPCR檢測相關(guān)基因表達(dá)情況。引物序列見表1。

表1 細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的QPCR引物序列

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1EGR1基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以人胎盤組織提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增得到外引和內(nèi)引產(chǎn)物分別為1 727 bp和1 697 bp的cDNA片段,見圖1A。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切、純化后，將其克隆到pcDNA3.1(-)EcoR Ⅰ/HindⅢ酶切位點得到pcDNA-EGR1重組質(zhì)粒(以下簡稱pEGR1)，重組子酶切和PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，各泳道片段大小均與理論值相符，鑒定為重組表達(dá)載體,見圖1B。測序結(jié)果與NCBI一致。該序列3′端加了HA標(biāo)簽，以便區(qū)分內(nèi)、外源EGR1蛋白。

2qPCR和Westernblotting檢測外源目的基因表達(dá)

首先對引物擴(kuò)增特異性進(jìn)行檢測，分析熔解曲線和定量曲線，如圖2A、B所示，擴(kuò)增產(chǎn)物有單一峰，且pV組與pEGR1組的峰形一致，表示該引物特異性擴(kuò)增EGR1基因。qPCR檢測目的基因EGR1 mRNA在實驗組細(xì)胞中的表達(dá)量是空載組的3 036倍,見圖2C。Western bloting結(jié)果顯示,pEGR1組中EGR1蛋白表達(dá)量較空載組高，見圖3。

Figure 1. Identification of human EGR1 cDNA and recombinant plasmid pcDNA-EGR1.(A):M:DL2000 DNA marker; 1,2: amplification production of EGR1 cDNA outside primer and inside primer→respectively.(B):M:5 000 bp DNA marker; 1-4:empty vector plasmid and pEGR1 plasmid without or with restriction enzyme digestion, respectively;5:amplification production of pEGR1 plasmid.

3EGR1過表達(dá)對U2OS細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞狀態(tài)的影響

MTT結(jié)果顯示(圖4)，pV組和低劑量pEGR1組的增殖率不存在顯著差異(P>0.05)；而高、中劑量組細(xì)胞的增殖率均有顯著差異(P<0.05)，并且pEGR1高劑量組的增殖率顯著低于中劑量組(P<0.05)。

流式細(xì)胞結(jié)果(圖5A)表明，pEGR1組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)；S期和G2/M期細(xì)胞比例則顯著減少(P<0.05)。 EGR1顯著增加了細(xì)胞凋亡率(P<0.05),見圖5B。

DAPI染色結(jié)果表明，與pV組相比，pEGR1組中細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的固縮，且有核破裂現(xiàn)象；pEGR1+sh601組中有GFP出現(xiàn)的細(xì)胞中，細(xì)胞核的凋亡特征消失,見圖6。

4EGR1對U2OS細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的影響

設(shè)計相關(guān)基因的特異性引物(表1)，qPCR檢測其表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示(圖7)，EGR1過表達(dá)時，與對照相比，PTEN、p53等明顯上調(diào)(P<0.01)；CDC2、CDK2等細(xì)胞周期相關(guān)基因則顯著下調(diào)(P<0.05)；凋亡相關(guān)基因家族成員caspase-6、caspase-9、caspasee-10顯著上調(diào)(P<0.05)，抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。與對照相比，shRNA干擾EGR1后，相關(guān)基因表達(dá)水平恢復(fù)到與pV組相似水平。

Figure 2. The transcription levels of EGR1 in U2OS cells transfected with pEGR1 or pV.EGR1 mRNA levels were determined by qPCR. U2OS cells were transfected with pEGR1 or pV plasmids for 48 h,then the mRNA levels were compared. A: solubility curve;B: quantitation curve analysis;C:EGR1 relative expression level.±s.n=3 **P<0.01 vs pV.

Figure 3. The EGR1 expression levels in U2OS cells transfected with pEGR1 or pV. EGR1 protein levels were determined by Western blotting. U2OS cells were transfected with pEGR1 or pV plasmids after 48 h, then the expression levels were compared.

Figure 4. MTT assay for U2OS cells transfected with pEGR1 or pV. After transfected with different concentrations of pEGR1 or pV plasmids for 48 h, the cell proliferation were significantly inhibited in U2OS with higher EGR1 expression.±s.n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs pV.

Figure 5. Effect of exogenous EGR1 on cell cycle and apoptotic rates of U2OS cells.s.n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs pV.

Figure 6. The typical morphology changes of apotosis observed under the fluorescence microscope by DAPI staining. After transfected with various plasmids for 48 h, the U2OS cells were fixed by polyoxymethylene and then stained with DAPI.A and C: white field of U2OS cells transfected with pV or pEGR1,respectively;B and D: DAPI staining of A and C, respectively;E: DAPI staining of cells transfected with pEGR1+sh601.Bar=50 μm.

Figure 7. Relative expression level of apoptosis-associated genes affected by exogenous EGR1 in U2OS cells.mRNA levels of PTEN,p53,CDC2,CDK2(A) and members of caspase family(B), were detected by qPCR assays.±s.n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs pV+shGAPDH.

討 論

Hayflick提出衰老細(xì)胞假說[9], 認(rèn)為機(jī)體內(nèi)細(xì)胞壽命有一定界限,即所謂的Hayflick界限。因此，細(xì)胞衰老是細(xì)胞脫離細(xì)胞周期后進(jìn)入一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)，是正常細(xì)胞的必然歸宿。

當(dāng)機(jī)體在各種致癌因素作用下，染色體損傷，細(xì)胞失去對其生長的正常調(diào)控，周期紊亂，分化受阻，出現(xiàn)衰老障礙，細(xì)胞異常增生而形成的 "不死"細(xì)胞群，即為腫瘤[10]。由腫瘤的發(fā)生機(jī)制來看，抑制腫瘤要從調(diào)控細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老與凋亡幾個方面入手。

研究表明[4,11]，經(jīng)典的腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)中，PTEN和p53等抑癌基因發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，有報道指出EGR1也參與其中，并扮演了重要的角色：EGR1在p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著“管家”作用[12]；EGR1通過Akt-EGR1-ARF-PTEN可以調(diào)控抑癌基因PTEN的表達(dá)[13]。我們通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，EGR1過表達(dá)后，U2OS細(xì)胞中PTEN和p53的表達(dá)確實明顯上調(diào)(P<0.01)；shRNA干擾EGR1表達(dá)后，細(xì)胞中二者的表達(dá)下調(diào)，提示在骨肉瘤細(xì)胞中，EGR1也可通過調(diào)控p53和PTEN發(fā)揮抑癌作用。

CDK2(cyclin-dependent kinase 2)和CDC2(cell division cycle 2)是推進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行的2種重要因子。二者的異常表達(dá)，能引起細(xì)胞周期紊亂和異常增殖，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[14]，本文經(jīng)qPCR檢測發(fā)現(xiàn)pEGR1可顯著抑制二者的表達(dá)(P<0.05)；shRNA干擾EGR1表達(dá)后，二者的表達(dá)水平與對照組一致；同時U2OS細(xì)胞中過表達(dá)不同劑量的EGR1后，細(xì)胞增殖受到顯著抑制(P<0.05)，且抑制率與EGR1呈一定的劑量依賴；此外，EGR1可引起瘤細(xì)胞群體停滯在G0/G1期。這些結(jié)果提示在骨肉瘤中，EGR1可能是通過抑制CDK2和CDC2基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，從而抑制了細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡是正常組織細(xì)胞更新的重要方式，也是清除異常和突變細(xì)胞的手段。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是EGR1發(fā)揮作用的重要方式[8]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)EGR1可顯著促進(jìn)凋亡率增加(P<0.05)，同時促進(jìn)細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮、核破裂等典型的凋亡表型，而shRNA可逆轉(zhuǎn)這種表型。這提示我們，EGR1可以促進(jìn)U2OS細(xì)胞凋亡。

在經(jīng)典誘導(dǎo)凋亡途徑中，保守的caspase家族是哺乳動物細(xì)胞中程序性死亡(PCD)的介導(dǎo)者和執(zhí)行者， caspase-3蛋白是整個caspase家族活化的關(guān)鍵因素[15]。本文研究發(fā)現(xiàn)EGR1過表達(dá)時，caspase-3表達(dá)增高，同時該家族其它成員如caspase-6、caspase-9、caspase-10的表達(dá)也顯著增高(P<0.05)。shRNA干擾EGR1表達(dá)后，這些基因表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05)；這表明，EGR1誘導(dǎo)的凋亡可能是通過激活caspase家族蛋白而執(zhí)行的。Bcl-2是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因素，而本實驗中未發(fā)現(xiàn)EGR1過表達(dá)后對其表達(dá)有顯著影響。提示EGR1誘導(dǎo)凋亡的信號途徑可能與caspase家族介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)，而與Bcl-2的線粒體凋亡途徑無關(guān)。

綜上所述，實驗證明瞬時過表達(dá)EGR1可以抑制骨肉瘤細(xì)胞U2OS的生長，使其凋亡率增加。其機(jī)制有可能是通過上調(diào)PTEN和p53的表達(dá)，進(jìn)一步激活caspase家族而最終引起細(xì)胞程序性死亡。

Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EGR1可抑制骨肉瘤細(xì)胞Saos2的增殖，但Saos2為p53-/-型，而U2OS為p53+/+，我們猜測EGR1在2種細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)制是有所不同的，因此本文在U2OS中進(jìn)行EGR1的瞬時表達(dá)研究，主要是為了判斷EGR1對U2OS的作用，為進(jìn)一步的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本文成功地將人EGR1基因克隆到了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中，并通過qPCR、免疫印跡、MTT、流式細(xì)胞術(shù)、DAPI染色和RNAi實驗等初步研究表明，在U2OS細(xì)胞中，EGR1具有抑制細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而引起細(xì)胞周期停滯和促進(jìn)凋亡作用，即具有抑癌的功能，因此下一步的工作是要建立合適的Tet-on穩(wěn)定誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合蛋白水平的驗證和分子機(jī)制的研究，以及EGR1在Saos2和U2OS中調(diào)控細(xì)胞生長機(jī)制的差異性著手，進(jìn)一步對EGR1在骨肉瘤中的功能深入研究。

總而言之，本研究為以后EGR1在骨肉瘤中抑癌機(jī)制的研究和臨床應(yīng)用研究提供了實驗依據(jù)，奠定了良好的前期工作基礎(chǔ)。

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TransientexpressionofexogenousEGR1affectscellcycleandapoptosisinhumanosteosarcomacells

QIN Li1, ZHANG Hui-hua1, GUO Shu-jun1, DUAN Fei-die1, CHEN You-peng2, LIANG Xu-jing2, CHEN Xiao-jia1

(1BioengineeringInstituteofJinanUniversity，NationalEngineeringResearchCenterofGeneticMedicine,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBioengineeringMedicine;2DepartmentofInfectiousDiseases,TheFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tchenxj@jnu.edu.cn)

AIM: To obtain the gene of human early growth response 1(EGR1) and to study its function by transient expression ofEGR1 in human osteosarcoma cell line U2OS.METHODSTotal RNA was extracted from human placenta and reverse transcription of the RNA to cDNA was performed. The whole length ofEGR1 cDNA was isolated by nest PCR and cloned into pcDNA3.1(-), which was named pcDNA-EGR1. The pcDNA-EGR1 was transfected into U2OS cells by LipofectimeTM2000. The over-expression level ofEGR1 was detected by real-time quantitative PCR and Western blotting. The effects ofEGR1 expression on cell proliferation, cell cycle and apoptosis were analyzed by MTT, DAPI staining and flow cytometry, respectively.RESULTSThe eukaryotic expression vector pcDNA-EGR1 was constructed successfully and high expression level ofEGR1 in transfected U2OS cells was observed. Compared with the control cells, the proliferation of U2OS cells transfected withEGR1 was significantly inhibited(P<0.05), the cell cycle was significantly arrested at G0/G1stage and the apoptotic rate was increased(P<0.05). In U2OS cells transfected withEGR1, over-expression of exogenousEGR1 induced nuclear condensation. The expression of CDK2 and CDC2 gene was down-regulated, while thecaspasegenes were up-regulated(P<0.05). The apoptosis phenotype and the expression levels of related genes influenced byEGR1 were restored to the levels of control cells by the shRNA method for knocking down ofEGR1.CONCLUSIONEGR1 inhibits the proliferation of U2OS cells, arrests the cell cycle and increases the apoptotic rate.

Genes,early growth response; Transient expression; Osteosarcoma cells; Growth inhibition

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-016

1000-4718(2011)02-0293-07

2010-08-06

2010-10-27

暨南大學(xué)211重點學(xué)科《生物技術(shù)與生物工程藥物》第三期預(yù)研資助項目;國家自然科學(xué)基金重大研究計劃項目(No.90919050)

△通訊作者 Tel：020-85220221; E-mail: tchenxj@jnu.edu.cn