楊思思, 張曉潔， 張木勛

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 武漢 430030)

Wnt在胰島素抵抗大鼠海馬Aβ沉積中的作用及羅格列酮治療前后Aβ的變化

楊思思, 張曉潔， 張木勛△

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 武漢 430030)

目的探討經(jīng)典Wnt通路中的配體Wnt3a及下游胞內(nèi)的β-catenin與胰島素抵抗(IR)大鼠模型海馬中β淀粉樣肽(Aβ)沉積的關(guān)系；觀察IR模型大鼠經(jīng)羅格列酮治療后，上述各指標(biāo)的改變及與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)的相關(guān)性。方法高糖、高脂、高蛋白飲食3個(gè)月造IR大鼠模型(IR)，給予羅格列酮灌胃4周為治療組(TZD)；葡萄糖氧化酶法檢測(cè)大鼠血糖水平，放免法檢測(cè)血漿胰島素水平，HOMA-IR評(píng)估胰島素抵抗水平，蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)Aβ、Wnt3a、β-catenin及PPARγ的水平。結(jié)果IR組血漿胰島素水平及胰島素抵抗程度顯著高于對(duì)照組。免疫印跡結(jié)果顯示，IR組大鼠海馬中Aβ及β-catenin表達(dá)增加，Wnt3a及PPARγ表達(dá)明顯減少；經(jīng)TZD干預(yù)后，大鼠海馬中Aβ表達(dá)減少，Wnt3a、β-catenin及PPARγ表達(dá)增加。結(jié)論胰島素抵抗大鼠海馬內(nèi)Wnt信號(hào)通路水平下降可能是導(dǎo)致Aβ沉積的原因。羅格列酮作為PPARγ激動(dòng)劑，可通過(guò)上調(diào)Wnt通路活性從而減少I(mǎi)R大鼠海馬內(nèi)Aβ的沉積。

胰島素抵抗； 淀粉樣β肽； Wnt信號(hào)通路； 羅格列酮；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)及高胰島素血癥在肥胖人群中常見(jiàn)，流行病學(xué)研究顯示IR是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)強(qiáng)烈的預(yù)測(cè)因子之一[1]。AD是一種與年齡相關(guān)的嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重?fù)p害患者的認(rèn)知功能，造成患者自理能力障礙及精神行為的異常。AD患者最典型的病理改變是：腦細(xì)胞外β淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)沉積導(dǎo)致的老年斑及腦神經(jīng)細(xì)胞軸突內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化所導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)[2]，并且認(rèn)為Aβ沉積是AD的始發(fā)病理生理學(xué)改變[3]。研究證實(shí)，腦內(nèi)胰島素信號(hào)受損可促使Aβ沉積[4]，并且IR及Aβ沉積均可導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路(the wingless pathway in Drosophila)下調(diào)[5，6]。

Wnt信號(hào)通路是Wnt配體介導(dǎo)的經(jīng)典信號(hào)通路，Wnt配體(如Wnt3a，是一類(lèi)分泌型糖蛋白，通過(guò)自分泌或旁分泌發(fā)揮作用)與其膜受體Frizzled結(jié)合介導(dǎo)了跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白(dishevelled protein，Dsh)，使得糖原合成激酶-3β( glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)結(jié)合到由軸蛋白(Axin)、大腸腺瘤性息肉蛋白(APC)及β-catenin組成的復(fù)合體上從而失去其活性，最后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin的水平增加，其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合最終使得Wnt目的基因表達(dá)增加。

噻唑烷二酮類(lèi)藥物(TZD)是迄今為止被認(rèn)為是最強(qiáng)的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)激動(dòng)劑，而PPARγ不僅是Wnt/β-catenin的目的基因之一，并且PPARγ與激動(dòng)劑結(jié)合后還能上調(diào)β-catenin基因轉(zhuǎn)錄。因此本研究首先觀察IR大鼠Aβ水平及通過(guò)檢測(cè)β-catenin和Wnt3a水平來(lái)評(píng)估Wnt途徑活性的改變，然后給予TZD干預(yù)改善IR后，通過(guò)檢測(cè)兩者的變化，探討羅格列酮是否通過(guò)Wnt途徑改善Aβ沉積，從而降低AD在IR中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象 雄性SD大鼠( 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)，體重180-220 g ，10-12周齡．隨機(jī)將大鼠分為3組：對(duì)照組予正常飲食飼養(yǎng)；肥胖胰島素抵抗模型組(IR) 予高脂高糖高蛋白飲食飼養(yǎng)；羅格列酮治療組(TZD)予高糖高脂高蛋白飼養(yǎng)3月，以羅格列酮片3.0 mg·kg-1·d-1灌胃4周(羅格列酮片由格蘭素史克公司提供)，對(duì)照組IR組均以等劑量生理鹽水灌胃。灌胃4周后斷頸處死所有大鼠，取海馬。

1.2主要試劑 見(jiàn)表1。

2觀察指標(biāo)及方法

2.1血糖測(cè)定(plasma glucose) 處死前由大鼠尾靜脈采血，用血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)豪)檢測(cè)血糖水平。

2.2血漿胰島素測(cè)定(plasma insulin) 于大鼠被處死前心臟取血1 mL，離心后取血漿，-20 ℃保存，放免法檢測(cè)。藥盒購(gòu)自北京原子能研究所, 測(cè)定值批內(nèi)CV<2.5%，批間CV<3.5%。

2.3胰島素抵抗指標(biāo) 以穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)HOMA -IR =空腹胰島素(U/L)×空腹葡萄糖(mmol/L)÷22.5表示。

2.4免疫印跡技術(shù)檢測(cè)大鼠海馬中Aβ、Wnt3a、β-catenin及PPAR-γ水平 斷頸處死動(dòng)物取海馬放入勻漿器內(nèi)，加入蛋白質(zhì)提取液，冰上勻漿(總蛋白質(zhì)提取液購(gòu)自武漢凌飛科技公司)。于4 ℃ 12 000×g離心10 min ，取上清即為蛋白質(zhì)。取10 μL用Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，余儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。用前?2×樣本緩沖液并混勻，于100 ℃變性5 min。在具10道雙垂直電泳槽孔內(nèi)加入約 12 μg蛋白質(zhì),10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，結(jié)束后全濕轉(zhuǎn)至NC膜。搖床上5%BSA封閉2 h，雜交I抗( 所有抗體如表 2所示) 4 ℃過(guò)夜，PBST洗膜3次，每次10 min，雜交Ⅱ抗(辣根酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠及兔抗羊IgG購(gòu)自Santa Cruz)，室溫?fù)u床上1 h，PBST洗膜3次，每次10 min。ECL試劑盒顯色(ECL試劑盒購(gòu)于武漢凌飛科技公司)。運(yùn)用BandScan 5.0軟件對(duì)免疫反應(yīng)條帶進(jìn)行定量分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 實(shí)驗(yàn)所用抗體

結(jié) 果

1血漿胰島素及胰島素抵抗程度比較

IR組大鼠胰島素水平顯著高于對(duì)照組，根據(jù)HOMA公式計(jì)算出的胰島素抵抗指數(shù)顯示IR組HOMA-IR顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明造模成功，見(jiàn)表2。

表2 動(dòng)物分組及一般資料

2免疫印跡技術(shù)檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)Aβ、Wnt3a、β-catenin及PPARγ的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠相比IR組大鼠海馬中Aβ及β-catenin表達(dá)增加，Wnt3a及PPARγ表達(dá)明顯減少；與IR組大鼠相比，TZD組大鼠海馬中Aβ表達(dá)減少，Wnt3a、β-catenin及PPARγ表達(dá)增加,見(jiàn)圖1。

Figure 1. Western blotting analysis of Wnt3a,β-catenin and PPAR-γ in rat hippocampi. A: Crude hippocampal extracts(7-13 μg/lane) were analyzed by Western blotting developed with antibodies to Wnt3a, β-catenin and PPARγ. β-actin served as a loading control. Each lane was from an individual rat. B: the blots as shown in panel A were quantitated densitometrically. ±s. n=5. *P<0.05,**P<0.01 vs control group; #P<0.05，##P<0.01 vs IR group.

討 論

IR程度是AD發(fā)病的強(qiáng)烈預(yù)測(cè)因子之一，腦內(nèi)胰島素信號(hào)受損可促使Aβ沉積[4]，并且胰島素抵抗程度及Aβ沉積的增加均可導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路下調(diào)[5，6]。TZD藥物是迄今為止被認(rèn)為最強(qiáng)的PPARγ受體激動(dòng)劑，臨床上多用于減輕IR。研究證實(shí)，PPARγ不僅是Wnt/β-catenin的目的基因之一，與激動(dòng)劑結(jié)合后還能上調(diào)其下游β-catenin的基因轉(zhuǎn)錄，本研究運(yùn)用TZD類(lèi)藥物羅格列酮改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，通過(guò)檢測(cè)Wnt信號(hào)途徑中β-catenin及Wnt3a水平觀察Wnt途徑活性改變，然后檢測(cè)大鼠大腦Aβ沉積狀態(tài)，探討TZD通過(guò)Wnt途徑改善胰島素抵抗大鼠大腦Aβ沉積狀態(tài)的可能機(jī)制。

本研究中，我們首先檢測(cè)具有胰島素抵抗特征的大鼠大腦Aβ沉積狀態(tài)，結(jié)果顯示，IR組大鼠比對(duì)照組大鼠大腦內(nèi)Aβ表達(dá)增多。檢測(cè)Wnt通路中重要組成成分，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，IR組β-catenin水平增高，Wnt3a表達(dá)減少。在胰島素抵抗時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路應(yīng)該是被抑制，因此理論上β-catenin應(yīng)該是表達(dá)減少的。分析在本實(shí)驗(yàn)中其β-catenin表達(dá)增多是因?yàn)樵贠B組中，IR導(dǎo)致Aβ增多，而Aβ增多可反饋性地增加β-catenin表達(dá)。這又是因?yàn)樵黾拥摩?catenin可直接減少Aβ的生成[7]。另外，β-catenin表達(dá)增加的同時(shí)Wnt3a表達(dá)反而是下降的，這說(shuō)明此時(shí)β-catenin表達(dá)增加，可能并不是通過(guò)Wnt3a配體激活Wnt/β-catenin經(jīng)典通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)閃nt經(jīng)典通路中Wnt3a及β-catenin的變化應(yīng)該是一致的：Wnt3a為Wnt經(jīng)典通路中的配體而β-catenin為配體下游的蛋白。然而，β-catenin的表達(dá)還受許多其它因素的影響，如非經(jīng)典Wnt通路及與GSK-3β有關(guān)的信號(hào)通路影響。另一研究也支持此推論：當(dāng)Aβ表達(dá)增多時(shí)它可與Wnt膜受體Frizzled的半胱氨酸域結(jié)合從而抑制Wnt/β-catenin經(jīng)典作用通路[8]。IR導(dǎo)致Aβ沉積的機(jī)制主要有2種學(xué)說(shuō)。(1)受損的胰島素信號(hào)通路對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶GSK-3β及GSK-3α的抑制作用減弱[9]。激活的GSK-3α可以激活A(yù)PPγ分泌酶從而增加Aβ的產(chǎn)生;而激活的GSK-3β可使得tau過(guò)度磷酸化從而導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)[10]，兩者都可加快疾病的進(jìn)程。(2)胰島素抵抗導(dǎo)致Aβ沉積是通過(guò)影響其清除及生成過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。Aβ被認(rèn)為主要是通過(guò)血腦屏障或是小膠質(zhì)細(xì)胞清除的，這個(gè)過(guò)程依賴(lài)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)及其配體ApoE和α2巨球蛋白[11]。而本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OB組比對(duì)照組海馬中Wnt3a明顯下降而Aβ沉積增加，因此我們推測(cè)IR導(dǎo)致Aβ沉積另一可能的機(jī)制是：IR時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制從而導(dǎo)致Aβ沉積。TZD治療組大鼠較OB組Aβ表達(dá)減少、Wnt3a及β-catenin表達(dá)增多、 PPARγ表達(dá)增多。依此推測(cè)羅格列酮可改善IR并且上調(diào)Wnt，經(jīng)典Wnt通路上調(diào)可使Aβ沉積減輕，同時(shí)羅格列酮的核受體PPARγ不僅是Wnt通路的目的基因之一[12]，并且當(dāng)羅格列酮作用與PPARγ結(jié)合后又可上調(diào)β-catenin基因的轉(zhuǎn)錄。PPARγ表達(dá)增多可增強(qiáng)羅格列酮的作用，并且上調(diào)β-catenin表達(dá)。

總之，AD作為IR患者的重要并發(fā)癥之一越來(lái)越受到人們重視，找出兩者間發(fā)病的關(guān)鍵及相關(guān)因素有望干預(yù)病情發(fā)展。Wnt/β-catenin通路在IR及AD發(fā)病中均起到重要作用，其可能為 IR患者患AD的病理生理學(xué)基礎(chǔ)之一。

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RoleofWntpathwayinAβdepositioninhippocampusofinsulinresistantratsbeforeandaftertreatedwithrosiglitazone

YANG Si-si, ZHANG Xiao-jie, ZHANG Mu-xun

(DepartmentofEndocrinology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:zmx1220@sina.com)

AIM: To investigate the relationship between classical Wnt pathway with β-amyloid peptide(Aβ) deposition in hippocampus of insulin resistance(IR) rat model and to observe the above-mentioned proteins and the correlation with peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ) by treating the IR rats with rosiglitazone.METHODSThe rat models of IR and TZD were made. The plasma insulin and the plasma glucose levels were tested by RIA and glucose-oxidase methods, respectively. The indexes of insulin resistance were calculated by HOMA-IR. The proteins of Aβ, Wnt3a, β-catenin and PPARγ were analyzed by Western blotting.RESULTSThe plasma insulin in IR group was significantly higher than that in control group. Insulin resistance, which was calculated by HOMA-IR, was significantly higher in IR group than that in control group. The levels of Aβ and β-catenin in IR group were higher than those in control group, while the levels of Wnt3a and PPARγ were decreased. After treatment with rosiglitazone, Aβ was reduced but Wnt3a, β-catenin and PPARγ were increased.CONCLUSIONIn hippocampus of IR rats, Aβ is deposited and the levels of Wnt3a and Wnt are reduced. Rosiglitazone, as a PPARγ agonist, can upregulate the activity of Wnt pathway and reduce Aβ deposition in rat hippocampus.

Insulin resistance; β-amyloid; Wnt signaling pathway; Rosiglitazone; Peroxisomal proliferator-activated receptor γ

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-031

1000-4718(2011)02-0375-04

2010-06-28

2010-10-12

△通訊作者 Tel:027-83663615； E-mail: zmx1220@sina.com