劉致中， 趙黎明， 武 飛， 岳長久， 李建新

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院泌尿外科， 內(nèi)蒙古 包頭 014010)

他克莫司對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響及其機制的研究

劉致中， 趙黎明△， 武 飛， 岳長久， 李建新

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院泌尿外科， 內(nèi)蒙古 包頭 014010)

目的探討他克莫司對大鼠腎缺血再灌注(I/R)損傷的保護作用及機制。方法將60只健康雄性Wistar大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組、I/R組和他克莫司處理組,每組各4個時點( 0.5 h、2 h、6 h、24 h)。建立腎I/R損傷模型;檢測各組大鼠血清肌酐(Cr)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腎組織病理變化；用免疫組化法檢測Fas和caspase-3蛋白的表達。結(jié)果在相應(yīng)再灌注各時點，他克莫司處理組血清Cr、TNF-α和MDA水平均低于I/R組(P<0.05)，而他克莫司處理組血清SOD活性高于I/R組(P<0.05)。他克莫司處理組腎組織損傷程度明顯輕于I/R組。與假手術(shù)組比較,I/R組凋亡蛋白Fas和caspase-3表達水平顯著增加(P<0.05),而他克莫司處理組凋亡蛋白Fas和caspase-3表達水平則低于I/R組(P<0.05)。結(jié)論他克莫司能有效抑制I/R引起的自由基產(chǎn)生、腎小管上皮細胞凋亡以及TNF-α水平降低，表明他克莫司對大鼠腎I/R損傷具有保護作用。

他克莫司； 再灌注損傷；腫瘤壞死因子； Fas； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是臨床常見的病理生理變化, 常見于急性失血、中毒性休克和器官移植手術(shù)等過程中。其發(fā)病機制尚未完全闡明。他克莫司是近年來在臨床常用的一種新型免疫抑制劑,新近有文獻報道新型免疫抑制劑他克莫司在使用過程中,低劑量的他克莫司預(yù)處理可以減輕組織或器官的I/R損傷[1]。本文旨在研究他克莫司對大鼠腎I/R損傷的保護作用, 并探討其作用機制。為他克莫司在臨床上用于腎I/R損傷的防治提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1試劑

他克莫司注射液由安斯泰來制藥有限公司惠贈，丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。兔抗大鼠Fas和caspase-3(Lab Vision)，Ⅱ抗免疫組化試劑盒購于天津津脈基因測繪技術(shù)有限公司。

2方法

2.1實驗動物與分組 選用健康雄性Wistar大鼠60只(購自內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心)，重量220-260 g。隨機分為3組：假手術(shù)(sham)組、I/R組和他克莫司處理(FK506+I/R)組,每組20只動物，各組又按時相不同分為0.5 h、2 h、6 h、24 h 4個亞組, 每個亞組5只動物。

2.2動物模型的建立及標本采集 建立動物模型，所有動物實驗前禁食12 h，自由飲水，將大鼠以20%烏拉坦5 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，作腹部正中切口，切除右腎，小心分離左腎動脈，保護輸尿管，用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈,45 min后恢復(fù)灌流，腎臟由暗紅色變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功。假手術(shù)組開腹后切除右腎, 分離左腎動脈, 但不夾閉左腎動脈；I/R組建立腎臟I/R損傷模型, 并于手術(shù)前6 h從尾靜脈注射生理鹽水1 mL;他克莫司處理組建立腎臟I/R損傷模型，并于手術(shù)前6 h從尾靜脈注射他克莫司注射液( 0.5 mg/kg)；于再灌注后0.5 h、2 h、6 h、24 h 處死動物,處死前下腔靜脈采血3 mL以備進行腎功能及血清TNF-α、MDA、SOD指標測定。并切除左腎,切除的左腎部分組織用10%中性甲醛固定以制備石蠟切片。

2.3血清肌酐(creatinine,Cr)、TNF-α、MDA含量和SOD活性的測定 從下腔靜脈取血3 mL, 離心后取血清。Cr采用全自動生化分析儀測定，TNF-α含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，MDA含量和SOD活性采用化學(xué)比色法，均按檢測試劑盒說明書操作。

2.4病理組織學(xué)觀察 切除的左腎部分腎組織于10%中性甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成4 μm厚的連續(xù)冠狀石蠟切片。按病理學(xué)常規(guī)制片、HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察腎組織損傷情況。

2.5免疫組化檢測Fas和caspase-3的表達 切取4 μm厚的石蠟切片, 常規(guī)脫蠟至水。嚴格按兔二步法免疫組化試劑盒操作。Fas和caspase-3陽性細胞結(jié)果為胞漿內(nèi)呈黃色或棕黃色染色，陰性對照以PBS代替Ⅰ抗。每張切片隨機采集5個高倍視野(×400)，每個視野計100個細胞，計算陽性細胞數(shù)。陽性細胞數(shù)為0，記作“-”;陽性細胞數(shù)25%以下為“+”;陽性細胞數(shù)25%-50%為“++”;陽性細胞數(shù)51%-75%為“+++”;陽性細胞數(shù)75%以上為“++++”。將表達強度評分，“+”為1分，“++”為2分，“+++”為3分，“++++”為4分。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1血清Cr和TNF-α含量的變化

在相應(yīng)再灌注各時點，I/R組與他克莫司處理組大鼠Cr值均高于假手術(shù)組；隨著再灌注時間的延長，I/R組Cr值明顯升高；在再灌注2 h、6 h和24 h，他克莫司處理組Cr的水平顯著低于I/R組(P<0.05)，I/R組Cr的水平與假手術(shù)組比差異顯著(P<0.05)，見表1。隨著再灌注時間的延長，I/R組血清TNF-α含量明顯升高；而他克莫司處理組隨著再灌注時間延長血清TNF-α含量升高不明顯，再灌注24 h，TNF-α含量反而出現(xiàn)降低；在再灌注各時點，他克莫司處理組TNF-α含量均顯著低于I/R組(P<0.05)，見表1。

表1 實驗各組不同再灌注時點Cr和TNF-α水平比較

2血清MDA含量和SOD活性的變化

與同一時點假手術(shù)組比較, I/R組大鼠血清MDA含量較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)；在再灌注相應(yīng)時點他克莫司處理組血清MDA含量低于I/R組(P<0.05)。在相應(yīng)再灌注各時點，與假手術(shù)組比較, I/R組血清SOD活性顯著降低(P<0.05)；他克莫司處理組血清SOD與I/R組比較，差異顯著(P<0.05)；在再灌注6 h、24 h，假手術(shù)組與他克莫司處理組也有顯著差異,見表2。

表2 實驗各組不同再灌注時點血清MDA含量和SOD活性的比較

3腎組織病理變化

光鏡下，假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常; I/R 組和他克莫司處理組在恢復(fù)再灌注后的0.5-2 h腎間質(zhì)血管內(nèi)都有充血表現(xiàn)，其中以0.5 h表現(xiàn)明顯。以后充血表現(xiàn)逐漸改善。I/R 組在再灌注6 h、24 h出現(xiàn)腎小管擴張，腎小管上皮細胞腫脹,細胞脫落,腎間質(zhì)血管擴張、充血伴炎癥細胞浸潤; 24 h小管形態(tài)損傷最嚴重，腎小管輪廓結(jié)構(gòu)消失，有的出現(xiàn)不同程度的片狀壞死。而他克莫司處理組病變程度較I/R 組明顯減輕，僅出現(xiàn)腎小管擴張，腎小管上皮細胞腫脹，間質(zhì)血管擴張、充血，見圖1。

Figure 1. The pathological changes of renal tissues at 24 h(×400).A:sham group; B:I/R group; C: FK506+I/R group.

4他克莫司對Fas蛋白表達的影響

Fas陽性細胞表達為胞漿內(nèi)呈黃色或棕黃色染色，陽性表達主要在腎小管上皮細胞以近曲小管、遠曲小管上皮細胞明顯，腎小球未見表達。I/R 組在再灌注的各時點表達均高于假手術(shù)組，在再灌注2 h、6 h、24 h，F(xiàn)as蛋白表達顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，I/R組和他克莫司處理組的差異顯著(P<0.05)；再灌注6 h、24 h假手術(shù)組與他克莫司處理組差異顯著(P<0.05)，見圖2、表3。

5他克莫司對caspase-3蛋白表達的影響

Caspase-3陽性細胞表達為胞漿內(nèi)呈黃色或棕黃色染色，陽性表達主要在腎小管上皮細胞以近曲小管、遠曲小管上皮細胞明顯，腎小球未見表達。I/R 組在再灌注的各時點表達均高于假手術(shù)組，在再灌注2 h、6 h、24 h，caspase-3蛋白表達顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，I/R組和他克莫司處理組的差異顯著(P<0.05)；再灌注24 h假手術(shù)組與他克莫司處理組差異顯著(P<0.05)，見圖3、表3。

Figure 2. Fas expression detected by immunohistochemistry at 24 h(×400). A: sham group; B:I/R group; C: FK506+I/R group.

Figure 3. Caspase-3 expression detected by immunohistochemistry at 24 h(×400). A:sham group; B:I/R group; C:FK506+I/R group.

表3 實驗各組不同再灌注時點腎組織Fas和caspase-3表達強度(分)的變化

討 論

他克莫司是從Tsukubaensis鏈球菌中提取出來的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過抑制T輔助細胞釋放IL-2及T殺傷細胞的增殖，從而抑制細胞和體液免疫反應(yīng)，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用，是近年來在器官移植中運用比較廣泛的一種新型免疫抑制劑[1]，研究發(fā)現(xiàn)它不僅能減輕再灌注后腎臟損傷的程度，而且能夠使損傷后的腎臟得到一定程度的修復(fù)和再生[2]。

近年研究表明，炎性細胞因子在腎I/R損傷的發(fā)病機制中起重要作用，其中TNF-α是參與腎I/R損傷的一個重要調(diào)節(jié)因子。腎I/R損傷時，TNF-α作為炎癥細胞因子被釋放，通過直接的細胞毒作用、誘導(dǎo)腎小球纖維蛋白沉積、收縮血管以致腎小球濾過率下降以及聚集中性粒細胞和單核細胞等亦能導(dǎo)致腎臟損傷[3,4]。因此，阻斷炎性細胞因子的釋放可能是減少I/R損傷的一條途徑。本實驗結(jié)果顯示，I/R組不同再灌注時點TNF-α水平明顯高于他克莫司處理組(P<0.05)，說明術(shù)前給予他克莫司預(yù)處理，可以降低I/R腎組織TNF-α水平，從而減輕腎I/R損傷程度。

氧自由基學(xué)說在腎I/R損傷機制中的作用已經(jīng)得到廣泛證實，在腎I/R過程中，氧自由基的大量形成和脂質(zhì)過氧化的增加是細胞損傷的主要病理過程之一。SOD是自由基的重要清除劑之一，也是體內(nèi)非常重要的抗氧化酶[5，6]。缺血再灌注的過程中，腎臟組織會產(chǎn)生大量的氧自由基，而腎臟內(nèi)的SOD等氧自由基清除劑因為缺血缺氧抑制了其活性，不能有效地清除氧自由基，以致氧自由基大量堆積。氧自由基能夠損傷生物膜上的脂質(zhì)，最終產(chǎn)生MDA，MDA也有細胞毒性作用，從而加劇I/R損傷[7]。我們的實驗結(jié)果表明，他克莫司處理組MDA含量明顯低于I/R組(P<0.05)，SOD活性明顯高于I/R組(P<0.05)。I/R組血Cr明顯高于他克莫司處理組。這表明他克莫司提高了SOD 的活性，保存有較好的氧自由基清除能力，能夠減輕I/R對腎組織的損傷。

研究表明[8],腎I/R損傷后除發(fā)生細胞壞死外,細胞凋亡也是其重要的死亡形式。細胞凋亡受多種凋亡相關(guān)基因及其蛋白的調(diào)控,Fas及其配體FasL同屬于TNF家族成員,當細胞表面表達Fas時,可激活FasL使兩者結(jié)合,使Fas死亡區(qū)交聯(lián),產(chǎn)生神經(jīng)酰胺,通過某種途徑,激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶,引起細胞凋亡,并向細胞內(nèi)傳遞死亡信號,數(shù)小時內(nèi)導(dǎo)致細胞死亡[9，10]。在很多病理條件下,凋亡相關(guān)蛋白Fas可通過激活caspase-3而介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。Caspase-3是人類白細胞介素1β轉(zhuǎn)化酶家族的重要成員之一,是激活細胞凋亡早期階段的關(guān)鍵蛋白酶,并在細胞凋亡過程中起著中心環(huán)節(jié)的作用?；罨腸aspase-3可通過水解特異性蛋白底物,從多方面促進凋亡的發(fā)生。如對結(jié)構(gòu)蛋白及看家蛋白actin、fodrin keratin等的水解,使細胞骨架結(jié)構(gòu)破壞[11]，最終導(dǎo)致細胞凋亡。

本實驗結(jié)果表明, I/R組Fas和caspase-3蛋白表達顯著升高,說明阻斷腎臟血運后，在恢復(fù)再灌注期間可以誘導(dǎo)腎臟Fas和caspase-3蛋白的表達，引起細胞凋亡。Fas和caspase-3蛋白于實驗各組腎小管上皮細胞均有表達,以腎近曲小管和遠曲小管表達較明顯,而腎小球未見表達。進一步觀察,與假手術(shù)組相比, I/R組Fas和caspase-3在缺血再灌注損傷后腎小管上皮細胞表達明顯增強,陽性細胞數(shù)顯著增加;經(jīng)他克莫司預(yù)處理后,腎小管上皮細胞Fas和caspase-3不僅表達強度顯著減弱,而且陽性細胞數(shù)也明顯減少。上述結(jié)果提示,他克莫司具有抑制Fas和caspase-3表達的作用,從而減少腎小管上皮細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述,他克莫司能通過降低腎I/R損傷時TNF-α和MDA水平，提高SOD活性，保護腎功能，并抑制細胞凋亡的發(fā)生，對大鼠腎I/R損傷具有一定的保護作用。

[1] Yang CW, Ahn HJ, Han HJ, et al. Pharmacological preconditioning with low-dose cyclosporine or FK506 reduces subsequent ischemia/reperfusion injury in rat kidn-ey[J].Transplantation, 2001,72(11):1753-1759.

[2] Sakr MF, McClain CJ, Gavaler JS, et al. FK506 pre-treatment is associated with reduced levels of tumor necrosis factor and interleukin 6 following hepatic ischemia/ reperfusion[J]. J Hepatol,1993,17(2):301-307.

[3] Meldrum KK, Hile K, Meldrum DR, et al. Simulated ischemia induces renal tubular cell apoptosis through a nuclear factor-κB dependent mechanism[J]. J Urol,2002, 168(1):248-252.

[4] Meldrum KK, Meldrum OR, Meng X, et al. TNF-α-dependent bilateral renal injury is induced by unilateral renal ischemia-reperfusion[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,282(2):H540-H546.

[5] 盧舜飛，孫麗娜，沈 佳，等.黑木耳多糖對抗大鼠慢性缺血性腦損傷[J].中國病理生理雜志，2010，26(4)：721-724.

[6] 朱穎婷,鄧新國,高 楊,等.碘酸鈉誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜損傷的病理改變和SOD、CAT的變化[J].中國病理生理雜志，2010，26(9)：1851-1854.

[7] Wink DA, Mitchell JB. Chemical biology of nitric oxide: Insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide[J]. Free Radic Biol Med,1998,25(3):434-456.

[8] Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N,et al.Induction of apoptosis in ischemia-reperfusion model of mouse kidney: possible involvement of Fas[J]. J Am Soc Nephrol, 1998, 9(4):620-631.

[9] 衛(wèi)立辛, 錢其軍. Fas介導(dǎo)凋亡的免疫學(xué)研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)：生理、病理學(xué)與臨床分冊, 1997, 17(4):289-291.

[10]Itoh N,Nagata S.A novel protein domain required for apoptosis.Mutational analysis of human Fas antigen[J]. J Biol Chem, 1993, 268(15):10932-10937.

[11]Kitazawa M, Anantharam V, Kanthasamy AG. Dieldrin induces apoptosis by promoting caspase-3-dependent proteolytic cleavage of protein kinase Cδ in dopaminergic cells: relevance to oxidative stress and dopaminergic degeneration[J].Neuroscience,2003,119(4):945-964.

Effectoftacrolimusonrenalischemia/reperfusioninjuryinrats

LIU Zhi-zhong, ZHAO Li-ming, WU Fei, YUE Chang-jiu, LI Jian-xin

(DepartmentofUrology,TheThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege,Baotou014010,China.E-mail:zhao_55liming@sina.com)

AIM: To investigate the protective effects and mechanism of tacrolimus on renal ischemia/reperfusion(I/R) injury in rats.METHODSSixty male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: sham-operated group, I/R group and tacrolimus group. After the renal I/R injury model was established, the serum content of creatinine(Cr), tumor necrosis factor-α(TNF-α)and malondialdehyde(MDA) and activity of superoxide dismutase(SOD) were measured at reperfusion time points of 0.5 h, 2 h, 6 h and 24 h. The renal histopathological lesions and the expression of Fas and caspase-3 were observed by the methods of microscopy and immunohistochemistry, respectively.RESULTSAt all the 4 time points, the levels of Cr, TNF-α and MDA in tacrolimus group were lower than those in I/R group(P<0.05). The SOD activity in tacrolimus group was higher than that in I/R group. Compared with I/R group, the renal histopathological lesions were improved, and the levels of Fas and caspase-3 were significantly decreased in tacrolimus group(P<0. 05).CONCLUSIONTacrolimus inhibits the production of free radical, the expression of TNF-α and apoptosis of renal tubular epithelial cells in renal I/R injury in rats, indicating that tacrolimus has protective function against renal I/R injury.

Tacrolimus; Reperfusion injury; Tumor necrosis factor; Fas; Caspase-3

R697

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-034

1000-4718(2011)02-0386-04

2010-06-18

2010-11-19

△ 通訊作者 Tel:0472-5992751; E-mail: zhao_55liming@sina.com