劉啟才， 王穎峰， 楊春祥， 李曉艷, 彭 燕, 彭 杰, 李 冰， 李 立

(1廣州醫(yī)學院實驗醫(yī)學研究中心， 廣東 廣州 510182； 2荊門市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 荊門 448000；3中山大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，4華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心影像介入科， 廣東 廣州 510060)

siRNA沉默LBH基因促進人支氣管上皮細胞周期進展*

劉啟才1△， 王穎峰1， 楊春祥2， 李曉艷3, 彭 燕1, 彭 杰1, 李 冰1， 李 立4△

(1廣州醫(yī)學院實驗醫(yī)學研究中心， 廣東 廣州 510182；2荊門市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 荊門 448000；3中山大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，4華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心影像介入科， 廣東 廣州 510060)

目的利用合成的小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細胞16HBE，觀察LBH(limb-bud and heart) 基因表達下調(diào)對16HBE細胞周期及相關(guān)基因表達的影響。方法脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染靶向LBH基因的siRNA到16HBE細胞，熒光定量RT-PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染后LBH基因表達，流式細胞術(shù)檢測LBH基因沉默后16HBE 細胞周期的改變，熒光定量RT-PCR及Western blotting檢測LBH基因沉默后細胞周期素E1和E2表達水平。結(jié)果50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細胞48 h后,LBH基因的表達水平只有對照組的14%；siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細胞48 h，其G1期細胞百分率比對照組減少9.28%，而S期細胞百分比增加14.08%；16HBE細胞在50 nmol/L siRNA的轉(zhuǎn)染后，細胞周期素E2的表達水平為對照組的2倍，而細胞周期素E1的表達沒有發(fā)生明顯改變。結(jié)論靶向于LBH基因的siRNA能有效沉默16HBE細胞中LBH基因的表達，LBH基因的表達下調(diào)促進了16HBE細胞周期G1/S期的進展；細胞周期素E2的表達上調(diào)參與了LBH沉默導致的細胞周期G1/S期的進展。

RNA干擾； 基因,LBH； 16HBE細胞； 細胞周期

應(yīng)用抑制性消減雜交獲得鼻咽癌組織和細胞系中的表達下調(diào)基因表達序列標簽(expressed sequence tags,ESTs) NP9(GenBank No.BF718797)[1,2]，通過序列同源比對，發(fā)現(xiàn)其序列與肢體及心臟早期發(fā)育過程中一種保守核蛋白表達基因(limb-bud and heart,LBH)[3]的同源性高達99%。研究發(fā)現(xiàn)LBH基因是脊椎動物中一個序列高度保守的組織特異性轉(zhuǎn)錄共活化因子(co-activator)，其在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[3-5]。前期研究結(jié)果提示與LBH同源的NP9基因的表達可通過下調(diào)增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和細胞周期素D1(cyclin D1)來抑制鼻咽癌細胞的裸鼠成瘤[6]，而對其在腫瘤發(fā)生中的作用和機制所知甚少。我們以LBH基因正常表達的人支氣管上皮細胞16HBE為模型[1]，通過基因沉默技術(shù)使LBH表達下調(diào)，觀察其沉默對16HBE細胞周期的影響并初步分析其機制，為闡明LBH基因的功能和探討該基因下調(diào)在腫瘤發(fā)病中的作用提供必要的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞系 人支氣管上皮細胞系16HBE由廣州醫(yī)學院實驗醫(yī)學研究中心保存和復蘇。

1.2主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及總RNA提取試劑Trizol、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品；熒光定量RT-PCR試劑盒為Stratagen產(chǎn)品。抗cyclin E1多克隆抗體為Alphagenix產(chǎn)品、抗cyclin E2及抗GAPDH抗體購自CST。

2方法

2.1siRNA合成 根據(jù)siRNA序列設(shè)計原則，利用Ambion公司網(wǎng)站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder)提供的siRNA設(shè)計工具，獲得沉默LBH基因(GenBank No. NM_030915)的靶序列AAGATGACTGAGGTGATGATG，根據(jù)靶序列合成正義和反義RNA鏈，序列分別為5′- GAUGACUGAGG UGAUGAUGTT -3′和3′- TTCUACUGACUCCACUACUAC -5′。提交序列給Ambion公司合成dsRNA.

2.2細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 16HBE細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。處于對數(shù)增長期的16HBE細胞按3×106cells/well接種6孔板后常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至90%融合度時，分別以25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L的特異siRNA及非特異siRNA轉(zhuǎn)染細胞,非特異siRNA用來陰性對照。轉(zhuǎn)染時每孔按對應(yīng)的濃度取一定量的siRNA和4 μL Lipofectamine 2000分別溶于250 μL無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中，待Lipofectamine 2000溶解5 min后，將脂質(zhì)體溶液與siRNA溶液混合，室溫放置20 min，最后將兩者的混合液加入含2 mL的完全培養(yǎng)液的6孔細胞培養(yǎng)板的各孔中，24 h后更換新培養(yǎng)基，并分別于轉(zhuǎn)染24 h和48 h后收集細胞。

2.3熒光定量 RT-PCR檢測LBH基因表達 設(shè)計人LBH基因和人GAPDH基因熒光定量RT-PCR引物(序列見表1)。提交引物序列給TaKaRa公司合成。按方法2.2最后收集的細胞加1 mL Trizol試劑裂解，提取細胞總RNA，取2 μg總RNA，按照Thermoscript first cDNA合成試劑盒說明書進行cDNA合成，然后以cDNA為模板，進行LBH基因、GAPDH基因的熒光定量RT-PCR反應(yīng)。熒光定量RT-PCR采用SYBR green I法，反應(yīng)體系包括： 2×master mix 25 μL； 2 μmol/L(上游+下游)引物 5 μL，100×ROX 0.5 μL，cDNA產(chǎn)物 2 μL，反應(yīng)在Stratagen Mx3000p上進行，運行條件為：先94 ℃ 10 min， 然后 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，在每個循環(huán)的第2步結(jié)束后收集熒光信號，以熒光信號對反應(yīng)循環(huán)數(shù)作圖。每個反應(yīng)設(shè)3個復孔，取平均Ct值，通過ΔΔCt法計算各組細胞中LBH基因的相對表達水平。

2.4細胞周期分析 以確定沉默LBH的有效siRNA量再次轉(zhuǎn)染16HBE 細胞，于48 h后0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，冰冷PBS清洗2次后，預冷的70%乙醇固定，4 ℃過夜，上機前離心除去乙醇，PBS清洗3次，100 mg/L RNase A 37 ℃消化40 min；50 g/L PI 4 ℃染色1 h，流式細胞儀檢測細胞DNA含量，確定siRNA轉(zhuǎn)染對細胞周期的影響。

2.5熒光定量RT-PCR檢測細胞周期素E1和E2 收集50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的16HBE細胞和對照組細胞，Trizol提取總RNA，然后用設(shè)計的細胞周期素E1和 E2 的引物(序列見表1)，按照方法2.3的操作和反應(yīng)條件對實驗組和對照組細胞的細胞周期素E1和 E2的表達進行熒光定量RT- PCR檢測，確定實驗組細胞中細胞周期素E1和E2的表達改變。

2.6Western blotting檢測細胞周期素E1和E2的表達 4.5×106個細胞接種25 cm2培養(yǎng)瓶，第2 d用50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染，48 h后收集轉(zhuǎn)染siRNA的16HBE細胞和對照組細胞，預冷的PBS(pH 7.4)洗3次，細胞裂解液裂解細胞，超聲處理，BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度，取80 μg蛋白上樣，進行丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜(cyclin E1、cyclin E2及GAPDH的稀釋度分別是：1∶500、1∶500和1∶1 000)，1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，加入發(fā)光底物，X光膠片感光，顯影和定影。

表1 熒光定量PCR的引物序列

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1siRNA轉(zhuǎn)染后LBH基因的表達

siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細胞后24 h，相對對照組(對照組為非特異性dsRNA)，25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L dsRNA轉(zhuǎn)染組均沒有發(fā)現(xiàn)LBHmRNA出現(xiàn)顯著下調(diào)。轉(zhuǎn)染48 h后，25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L轉(zhuǎn)染組細胞出現(xiàn)不同程度的LBH表達下調(diào)，以50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染組最為顯著(P<0.05)，其LBHmRNA水平只有對照組細胞的14%，見圖1， siRNA濃度達到100 nmol/L，LBH表達水平未見更明顯的下調(diào)。

Figure 1. The relative expression of LBH mRNA detected by real-time RT-PCR after siRNA transfection for 24 h and 48 h.±s. n=6.*P<0.05 vs control.

2細胞周期的改變

50 nmol/L siRNA 轉(zhuǎn)染16HBE細胞48 h，與對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染組細胞的細胞周期出現(xiàn)G1期細胞百分比減少和S期細胞百分比增加，G1期細胞從對照組的67.30%減少為58.02%，S期細胞從對照組的21.54%增加到35.62%,見圖2，呈現(xiàn)明顯的細胞周期G1/S期的進展。

Figure 2. The effect of LBH gene silencing on the 16HBE cell cycle.A:control;B:siRNA.

3LBH表達下調(diào)對細胞周期素E1和E2表達的影響

50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細胞48 h后，熒光定量RT-PCR檢測顯示，以對照組細胞中細胞周期素E1和E2的表達水平為100%，轉(zhuǎn)染組細胞中細胞周期素E1相對表達量為106%，而細胞周期素E2表達達到對照組的1.89倍,見圖3。對蛋白表達的檢測顯示：50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染48 h的16HBE細胞，其細胞周期素E2相對表達水平為對照組2.06倍(P<0.05)；細胞周期素E1蛋白的表達水平在沉默組和對照組之間差異不顯著(P>0.05),見圖4。

討 論

鼻咽癌組織中的低水平表達LBH蛋白，因其在鼻咽癌組織和細胞系中呈現(xiàn)普遍表達下調(diào)，并且在鼻咽癌細胞中表達LBH后能抑制鼻咽癌細胞的生長和裸鼠致瘤，從而推測LBH為鼻咽癌易感基因的候選者[1,2,6]。因此通過構(gòu)建LBH表達下調(diào)的上皮細胞模型，確定LBH表達下調(diào)對上皮細胞的影響，能夠有效揭示LBH表達缺失在鼻咽癌中的作用。目前RNAi(RNA interference)是最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而下調(diào)相應(yīng)蛋白表達[7,8]。

我們以LBH基因正常表達的人支氣管上皮細胞16HBE為模型，采用體外合成的靶向于LBH基因的siRNA，在轉(zhuǎn)染16HBE細胞后，通過LBHmRNA表達水平的檢測確定了沉默LBH基因的條件，藉此成功建立了LBH表達下調(diào)的16HBE的細胞模型。由于前期結(jié)果證實對細胞周期的影響與LBH基因的抑瘤功能有關(guān)[6]，而且基因芯片檢測提示表達LBH鼻咽癌細胞中的細胞周期素E2的表達顯著下調(diào)[9]，因此在LBH基因沉默后，對細胞周期進行了觀察。結(jié)果顯示16HBE細胞在LBH沉默后表現(xiàn)為細胞周期G1/S期進展的加速，確定了LBH基因在細胞周期調(diào)控中的作用。

Figure 3. The relative expression of cyclin E1 and E2 mRNA examined by real-time RT-PCR after siRNA transfection for 48 h.±s.n=6.*P<0.05 vs negative control.

Figure 4. The expression of protein cyclin E1 and E2 after siRNA transfection for 48 h.±s. n=6. *P<0.05 vs negative control.

通常認為在細胞周期的進展中，當細胞通過G1期后就會到達受CDK2控制的G1/S期檢測點，在此檢測點，細胞周期素E1和E2與CDK2結(jié)合形成的復合物通過誘導RB蛋白的磷酸化推動細胞進入S期，因此細胞周期素E1和E2在細胞周期G1/S期進展中起重要作用[10]。16HBE細胞中的LBH基因沉默后，實際上僅僅表現(xiàn)為細胞周期素E2的表達上調(diào)，而細胞周期 E1沒有發(fā)生明顯改變，說明LBH對細胞周期素E2的特異調(diào)控。在原發(fā)性乳腺癌、卵巢癌、子宮癌和肺癌中均發(fā)現(xiàn)有細胞周期素E2的表達上調(diào)，表明其在腫瘤發(fā)生中的重要作用[11,12]。因此在上皮細胞中LBH對細胞周期的負性調(diào)控一定程度地揭示了LBH下調(diào)在腫瘤發(fā)生中的作用機制。

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RNAi-mediatedknocking-downofLBHgenepromotescellcycleprogressin16HBEcells

LIU Qi-cai1, WANG Ying-feng1, YANG Chun-xiang2, LI Xiao-yan3, PENG Yan1, PENG Jie1, LI Bing1, LI Li4

(1ExperimentMedicalResearchCenter,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510182,China;2DepartmentofNeurology,TheSecondHospitalofJingmenCity,Jingmen448000,China;3DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospital,4StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthernChina,ImagingDiagnosisandInterventionalCenter,CancerCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail:liuqicai968@yahoo.com.cn;li2@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of small interfering RNA(siRNA) on limb-bud and heart(LBH) gene expression in 16HBE cells, and further to observe the change of 16HBE cell cycle after knocking down ofLBHgene.METHODSSynthetical siRNA targetingLBHgene was transfected into 16HBE cells by the method of lipofectamine 2000. The mRNA expression ofLBHwas examined by real time RT-PCR. The cell cycle was assayed by flow cytometry. The expression of cyclin E1 and E2 was also detected by real time RT-PCR and Western blotting.RESULTSThe expression ofLBHgene decreased by 86% in 16HBE cells transfected with 50 nmol/L of siRNA for 48 h. After transfected with siRNA for 48 h, 16HBE cells in G1phase decreased by 9.28% and the cells in S phase increased by 14.08%. The expression level of cyclin E2 in 16HBE cells transfected with siRNA was twice higher than that of the negative control cells.CONCLUSIONSequence-specific siRNA targetingLBHis capable of suppressingLBHgene expression in 16HBE cells. Down-regulation ofLBHexpression in 16HBE cells may promote the progress of cell cycle, and up-regulation of cyclin E2 expression plays a role in the process of G1/S phase.

RNA interference; Genes,LBH; 16HBE cells; Cell cycle

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-027

1000-4718(2011)02-0357-04

2010-09-01

2010-11-30

廣東省自然科學基金資助項目(No.06301124)；廣州市屬高校科技計劃資助項目(No.61093)；國家自然科學基金資助項目(No.81071207)

△通訊作者 Tel：020-81340204；E-mail:liuqicai968@yahoo.com.cn；Tel：020-87343476；E-mail:li2@mail.sysu.edu.cn