許 華， 何 清， 鄧淑琴, 查慶兵

( 暨南大學(xué)1藥學(xué)院，2附屬第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510632)

Sox-2基因表達(dá)的變化在小鼠EST模型藥物胚胎毒性評價中的應(yīng)用*

許 華1△， 何 清1， 鄧淑琴1, 查慶兵2

( 暨南大學(xué)1藥學(xué)院，2附屬第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510632)

目的： 建立小鼠胚胎干細(xì)胞實驗 (EST) 模型，驗證該模型檢測胚胎毒性的有效性，探討未分化基因Sox-2表達(dá)水平的變化對藥物胚胎毒性評價的作用。方法體外培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)，通過形態(tài)學(xué)觀察、核型分析和堿性磷酸酶(AKP)染色等方法鑒定ES；MTT法檢測5-氟尿嘧啶(5-FU)、苯妥英鈉(DPH)和青霉素G(penicillin G)對ES的毒性作用，RT-PCR半定量分析法檢測3種藥物對未分化基因Sox-2表達(dá)的影響。結(jié)果成功建立EST 模型。5-FU、DPH和penicillin G細(xì)胞毒性檢測結(jié)果表明，其胚胎毒性依次為強、弱和無，與臨床藥物毒性相一致。Sox-2基因表達(dá)結(jié)果顯示，隨藥物濃度增高及毒性增加，Sox-2基因表達(dá)量逐漸高于陰性對照組，但均低于未分化ES細(xì)胞。結(jié)論研究結(jié)果顯示，Sox-2基因的表達(dá)水平與藥物毒性密切相關(guān)，可用于初步評價EST模型中藥物的胚胎毒性。

模型,小鼠胚胎干細(xì)胞； 胚胎毒性； 有效性; 基因,Sox-2

自從1981年Martin、Evans等成功地分離培養(yǎng)出未分化小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)細(xì)胞以來，國內(nèi)外學(xué)者已相繼建立了大鼠、小鼠、豬、靈長類等多種動物的ES細(xì)胞系。但迄今，只有在小鼠、猴、人類中建立的ES 細(xì)胞系可以在體外長期增殖，且能維持其未分化狀態(tài)[1]，其中又以小鼠胚胎干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)較為簡單易行而被廣為用之?，F(xiàn)有的胚胎干細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ?embryonic stem cell test，EST)大多通過檢測待測物的細(xì)胞毒性及其對分化的抑制作用來確定其發(fā)育毒性[1,2]。如采用搏動心肌數(shù)或心肌細(xì)胞特異性表達(dá)基因，評價某受試物是否具有抑制ES細(xì)胞分化的毒性[3]。但有些藥物如生長因子類，由于其本身促細(xì)胞增殖及促分化的生物學(xué)特性[4]，如單獨以細(xì)胞毒性及對某一細(xì)胞和器官分化的抑制作用來確定其胚胎毒性，可能具有片面性和不確定性。如能找到一種具有更廣泛意義的ES細(xì)胞分化程度的標(biāo)記物，可能會增加該模型評價胚胎發(fā)育毒性的受試物范圍。

在保持ES細(xì)胞的基本特性和生物的早期發(fā)育中，Oct-4和Nanog被認(rèn)為是兩個基本調(diào)節(jié)器，而Sox-2則通過和Oct-4組成異二聚體發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用。三者的表達(dá)水平和功能狀態(tài)將直接對ES細(xì)胞的多潛能性和自我更新乃至生物的早期發(fā)育產(chǎn)生影響。Sox-2與Oct-4基因在桑椹胚、ICM、上胚層和生殖細(xì)胞中的表達(dá)廣泛重疊，不僅提示二者在維持多潛能性方面的平行作用，而且可把Sox-2作為早期鼠胚多能性譜系細(xì)胞的一個標(biāo)志物[5]。本研究的目的是建立小鼠EST模型，以細(xì)胞毒性及未分化特異性基因Sox-2表達(dá)兩個方面指標(biāo)，檢測5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)、苯妥英鈉(diphenylhydantoin sodium，DPH)和青霉素G(penicillin G)的胚胎發(fā)育毒性，以驗證該方法的有效性，為EST模型的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級昆明小鼠，雌雄各半，6-8周齡，體質(zhì)量(20±2) g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號為SCXK粵2008-0002。

1.2細(xì)胞株 ES細(xì)胞由廣州醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所孫筱放教授惠贈；3T3細(xì)胞購自中山醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫。

1.3試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、新生牛血清、非必需氨基酸、明膠、絲裂霉素C(mitomycin)、胰蛋白酶購于Gibco，特級胎牛血清購于Hyclone、白血病抑制因子(leukemia inhibitor factor,LIF)購自Chemicon，RT-PCR試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司、RNA 快速提取試劑盒購于廣州東盛生物科技有限公司，Taq DNA聚合酶購于北京康為世紀(jì)公司。DPH系天津力生制藥股份有限公司產(chǎn)品，青霉素G系華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，5-FU系華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。ES細(xì)胞培養(yǎng)液(高糖DMEM，20％ Hyclone胎牛血清，0.1 mol/L 2-巰基乙醇，1 mol/L谷氨酰氨，0.1 mol/L非必須氨基酸，1×105U/L青霉素．1×105U/L鏈霉素、1×105U/L LIF)。

2方法

2.1小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)

① 飼養(yǎng)層細(xì)胞即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)的制備 制作方法參考文獻(xiàn)[6]，取懷孕13-14 d 的雌鼠,以胰酶消化法得到原代MEF細(xì)胞。通常取2-4代細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。以終濃度為10 mg/L絲裂霉素C作用MEF 2.5 h，處理過的MEF細(xì)胞以3.0×104cells/cm2密度均勻地鋪在明膠處理過的培養(yǎng)瓶上，鋪好的飼養(yǎng)層在1-7 d內(nèi)都可以較好地支持小鼠ES細(xì)胞的生長并維持其全能性。

② 小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng) 從凍存狀態(tài)復(fù)蘇小鼠胚胎干細(xì)胞，在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)2 d左右。然后用胰酶消化下來，傳代至只鋪有明膠的器皿內(nèi)，培養(yǎng)18-36 h，即可去除飼養(yǎng)層細(xì)胞的干擾。

2.2小鼠ES細(xì)胞的鑒定

① 形態(tài)觀察 相差顯微鏡觀察ES細(xì)胞的生長行為及形態(tài)特征。

② 核型分析 取生長旺盛的ES細(xì)胞，以終濃度為5 mg/L的秋水仙素作用2.5 h，空氣干燥法制片，Giemsa染色，油鏡下觀察細(xì)胞分裂相染色體情況。

③ 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色 用含7.5％蔗糖的4％多聚甲醛固定細(xì)胞10-15 min;再用 75 g/L硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)和50 g/L 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP)染色液染色1 h。

④ 未分化標(biāo)記物Oct-4和Sox-2的測定 提取ES細(xì)胞和作為對照的MEF細(xì)胞的RNA，經(jīng)RT-PCR檢測ES細(xì)胞中未分化特異性基因Oct-4和Sox-2的表達(dá)。

⑤ 懸滴培養(yǎng)觀察ES細(xì)胞分化行為 將胚胎干細(xì)胞與培養(yǎng)基混合后，以100滴/培養(yǎng)皿(每滴30 μL，含約750個細(xì)胞)的量置于100 mm培養(yǎng)皿蓋上，培養(yǎng)皿內(nèi)放入PBS溶液15 mL，將培養(yǎng)皿蓋倒扣于培養(yǎng)皿上，則細(xì)胞懸滴于培養(yǎng)皿蓋上。將此培養(yǎng)皿放入37 ℃ 、5％CO2孵箱中3 d。3 d后于倒置顯微鏡下可見每1個懸滴中有1個干細(xì)胞團(tuán)(embryonic body,EB)，將這些EBs轉(zhuǎn)移至60 mm培養(yǎng)皿中，分別加入10 mL含不同濃度受試物的培養(yǎng)基，輕晃培養(yǎng)液，使其懸浮于培養(yǎng)液中生長2 d，可獲得類胚體。類胚體繼續(xù)分化可見中空的囊胚，并貼壁分化成多種類型細(xì)胞。

2.3EST有效性驗證 選擇發(fā)育毒性依次為無、弱、強的penicillin G、DPH和5-FU，分別求IC503T3、IC50ES、ID50ES。

① 應(yīng)用EST模型對受試物細(xì)胞毒性(IC50)的檢測 將500個/200 μL的3T3細(xì)胞和ES細(xì)胞分別接種在96孔的培養(yǎng)板上，5-FU濃度為0.01-0.12 mg/L 11個濃度，DPH濃度為20-160 mg/L 8個濃度，penicillin G濃度為200-1 400 mg/L 7個濃度[7]，每濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)立陰性對照組(即每藥的0 mg/L組)。第3 d和第5 d更換培養(yǎng)基，第10 d，用MTT法檢測細(xì)胞活性，于570 nm處檢測量其吸光度，分別計算3個藥物的IC50ES和IC503T3。

② 應(yīng)用EST模型對受試物抑制胚胎干細(xì)胞體外分化能力(ID50)的檢測 受試物用無LIF ES培養(yǎng)基稀釋，制備含不同濃度受試物的培養(yǎng)基。5-FU濃度為0.02、0.03、0.04、0.05和0.06 mg/L，DPH濃度為40、60、80、100和120 mg/L，penicillin G濃度為1 000、1 200、1 400、1 600和1 800 mg/L。按上述懸滴培養(yǎng)的方法，將胚胎干細(xì)胞與上述制備的含不同濃度受試物的培養(yǎng)基混合后，使形成EB，繼續(xù)放人37℃、5％CO2，EB貼壁，在孵箱中培養(yǎng)5 d。于分化第10 d，采用RT-PCR方法，分別檢測所培養(yǎng)ES中未分化的特異表達(dá)基因Sox-2和對照管家基因(GAPDH)的表達(dá)量進(jìn)行半定量灰度分析，相關(guān)引物見表1，求出各受試物相對應(yīng)的產(chǎn)生50％細(xì)胞分化抑制作用濃度，即ID50ES。

表1 Oct-4、Sox-2和內(nèi)對照管家基因(GAPDH)的引物

③ 結(jié)果判定 受試物發(fā)育毒性結(jié)果的計算公式[8]：

Ⅰ.5.9157 lg(IC503T3)+3.500 lg(IC50ES)-5.307(IC503T3- ID50ES)/ IC503T3-15.72

Ⅱ.3.6511 lg(IC503T3)+2.3941 lg(IC50ES)-2.033(IC503T3- ID50ES)/ IC503T3-6.85

Ⅲ.-0.125 lg(IC503T3)+1.917 lg(IC50ES)+1.500(IC503T3- ID50ES)/ IC503T3-2.67

受試物發(fā)育毒性的判定標(biāo)準(zhǔn) ：上述結(jié)果中，Ⅰgt;Ⅱ且Ⅰgt;Ⅲ，則受試物發(fā)育毒性為1級，即無胚胎毒性；Ⅱgt;Ⅰ且Ⅱgt;Ⅲ，則受試物發(fā)育毒性為2級，即弱胚胎毒性；Ⅲgt;Ⅰ且Ⅲgt;Ⅱ，則受試物發(fā)育毒性為3級，即強胚胎毒性。

結(jié) 果

1ES細(xì)胞鑒定結(jié)果

1.1形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下，ES細(xì)胞呈克隆狀生長，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細(xì)胞界限不清，消化成單細(xì)胞后可見細(xì)胞小而圓，核大，胞漿小,見圖1 。

Figure 1.The embryonic stem cells cultured on mouse embryonic fibroblasts (×200).

1.2核型分析 具有正常二倍體核型，共40條染色體,見圖2。

Figure 2.The karyotype of embryonic stem cells (×400).

1.3堿性磷酸酶(AKP)染色 用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)染色液染色形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的結(jié)晶,見圖3。

Figure 3.The alkaline phosphatase staining of embryonic stem cells(×100).

1.4標(biāo)記物Oct-4和Sox-2的測定 未分化標(biāo)志性基因Oct-4和Sox-2均有高效表達(dá),見圖4。

Figure 4.The expression of undifferentiated gene Oct-4 and Sox-2 in embryonic stem cells.M：marker；1,3,5：the expression of Oct-4,GAPDH and Sox-2 in undifferentiated embryonic stem cells,respectively；2,4,6：the expression of Oct-4,GAPDH and Sox-2 in MEF cells,respectively.

1.5類胚體的生長行為 去除LIF的培養(yǎng)基分化培養(yǎng)10 d能獲得類胚體，類胚體繼續(xù)分化可見中空的囊胚，并貼壁分化成多種類型細(xì)胞,見圖5。

Figure 5.The blastula differentiated from embryoid (×100).

2小鼠EST模型對受試物發(fā)育毒性評價

2.1受試物細(xì)胞毒性評價 5-FU、DPH和penicillin G細(xì)胞毒性檢測結(jié)果顯示，隨藥物濃度加大，細(xì)胞的存活率明顯下降，ES細(xì)胞顯示出比3T3細(xì)胞更敏感的細(xì)胞毒性。5-FU、DPH和penicillin G的IC50ES分別為0.03900 mg/L、68.60 mg/L、962.0 mg/L；IC503T3依次為0.05400 mg/L、138.8 mg/L、1 475 mg/L,見圖6-8。

2.2受試物對分化影響評價 RT-PCR半定量分析檢測結(jié)果顯示，未分化的ES細(xì)胞有Sox-2的高效表達(dá)，分化后的ES細(xì)胞Sox-2表達(dá)明顯下降。隨5-FU、DPH和penicillin G濃度的增加，表現(xiàn)為Sox-2的表達(dá)量逐漸高于陰性對照組，表明細(xì)胞分化受到不同程度抑制。5-FU、DPH和penicillin G的ID50分別為0.02400 mg/L、46.45 mg/L和1 018 mg/L,見圖9-11。

Figure 6.The toxic effect of different concentrations of 5-FU on embryonic stem cells and 3T3 cells.

Figure 7.The toxic effect of different concentrations of DPH on embryonic stem cells and 3T3 cells.

Figure 8.The toxic effect of different concentrations of penicillin G on embryonic stem cells and 3T3 cells.

Figure 9.The expression of Sox-2 in ES cells after exposed to 0 -0.06 mg/L 5-FU for 10 days.M:DL2000 marker; lane 1 and 8: Sox-2 and GAPDH expression in undifferentiated ES cells,respectively; lane 2-7: Sox-2 expression in ES cells that were treated with 0.06,0.05,0.04,0.03,0.02 and 0 mg/L 5-FU,respectively; lane 9-14: GAPDH genes expression in ES cells that were treated with 0.06,0.05,0.04,0.03,0.02 and 0 mg/L5-FU,respectively.

Figure 10.The expression of Sox-2 in ES cells after exposed to 0 - 120 mg/L DPH for 10 days.M: DL2000 marker; lane 1 and 8: Sox-2 and GAPDH expression in undifferentiated ES cells,respectively; lane 2 - 7: Sox-2 expression in ES cells that were treated with 120,100,80,60,40 and 0 mg/L DPH,respectively; lane 9 - 14: GAPDH expression in ES cells that were treated with 120,100,80,60,40 and 0 mg/L DPH,respectively.

Figure 11.The expression of Sox-2 in ES cells after exposed to 0 - 1 800 mg/L penicillin G for 10 days.M: DL2000 marker; lane 1 and 8: Sox-2 and GAPDH expression in undifferentiated ES cells,respectively; lane 2 - 7: Sox-2 expression in ES cells that were treated with 1 800,1 600,1 400,1 200,1 000 and 0 mg/L penicillin G,respectively; lane 9 - 14: GAPDH expression in ES cells that were treated with 1 800,1 600,1 400,1 200,1 000 and 0 mg/L penicillin G,respectively.

2.3受試物發(fā)育毒性的判定結(jié)果 將上訴結(jié)果代入判定公式中，得出5-FU，Ⅲgt;Ⅰ且Ⅲgt;Ⅱ，則發(fā)育毒性為3級，即強胚胎毒性；DPH，Ⅱgt;Ⅰ且Ⅱgt;Ⅲ，則發(fā)育毒性為2級，即弱胚胎毒性；penicillin G，Ⅰgt;Ⅱ且Ⅰgt;Ⅲ，則發(fā)育毒性為1級，即無胚胎毒性。

討 論

ES細(xì)胞具有體外分化潛能，EST對受試物的檢測終點由2個部分組成的，一為細(xì)胞毒性，二為胚胎毒性，通過檢測受試物對ES細(xì)胞分化的影響，結(jié)合ES細(xì)胞與纖維母細(xì)胞(BALB/c 3T3)細(xì)胞毒性實驗的結(jié)果，可以初步判斷受試物對胚胎發(fā)育的毒性[9，10]。因有些受試物在低濃度時即可抑制ES細(xì)胞分化，而其細(xì)胞毒性的濃度卻高出很多個數(shù)量級，所以將2個毒性濃度指標(biāo)(IC50和ID50)進(jìn)行綜合考慮和計算分析，對于最終正確判定受試物產(chǎn)生胚胎毒性的強弱有更實際的意義[11]。本實驗成功建立了EST模型，按照歐洲替代試驗方法驗證中心(European Center for Validation Alternative Methods，ECVAM)推薦的體外胚胎發(fā)育毒性評價方法，并采用未分化基因Sox-2的表達(dá)作為衡量分化程度的指標(biāo)，對5-FU、DPH和penicillin G的胚胎毒性進(jìn)行了檢測和判斷。結(jié)果表明，三藥的胚胎毒性依次為強、弱、無，該判定結(jié)果與ECVAM所確定的受試物的發(fā)育毒性結(jié)論一致，說明本研究依據(jù)ECVAM的原則經(jīng)過改良所建立的EST實驗?zāi)Ｐ驮谶M(jìn)行受試物的發(fā)育毒性篩選和評價時，對受試物可能的發(fā)育毒性判斷具有準(zhǔn)確性。

Oct-4和Sox-2基因是小鼠胚胎發(fā)育早期生殖細(xì)胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能干細(xì)胞特異性表達(dá)的一種發(fā)育多能性的標(biāo)志基因，是ES細(xì)胞全能性的標(biāo)志，被廣泛用于鑒定胚胎干細(xì)胞是否處于未分化狀態(tài)。在體外,Sox-2 基因在未分化的ES細(xì)胞中表達(dá)，且隨著細(xì)胞分化表達(dá)下調(diào)[12]，其表達(dá)量直接反映了ES細(xì)胞的分化程度，因而，可選擇Sox-2評價受試物對ES細(xì)胞分化的影響。從本研究中5-FU、DPH和penicillin G對Sox-2基因的影響也可以看出Sox-2基因在ES細(xì)胞的分化受到抑制時，其表達(dá)量能維持在較高水平，且抑制程度越高，其表達(dá)量也越高，說明測定受試物對Sox-2基因表達(dá)的影響，可初步判斷其對分化是否具有影響及其程度，結(jié)合細(xì)胞毒性試驗結(jié)果，可綜合評價該受試物的胚胎發(fā)育毒性。

現(xiàn)代藥理與毒理研究已不僅僅局限于簡單的整體動物實驗，而是越來越深入到細(xì)胞和分子水平，從而能從蛋白質(zhì)、酶、受體、分子通道及遺傳因素等多方面更深層次地了解和分析藥物與機體相互作用的機制[13]。本試驗結(jié)合細(xì)胞活性和Sox-2基因的測定，從細(xì)胞毒性和對分化影響兩個方面檢測藥物的生殖發(fā)育毒性，大大提高該方法的實用性和科學(xué)性，為我們進(jìn)一步研究和篩選其它藥物的生殖發(fā)育毒性打下了基礎(chǔ)。

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中國病理生理學(xué)會2011年活動計劃表

ExpressionofSox-2inmouseembryonicstemcelltestforscreeningdrugswithembryotoxicity

XU Hua1,HE Qing1,DENG Shu-qin1,ZHA Qing-bing2

(1PharmacyCollege,2DepartmentofFetalMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:huax-mail@163.com)

AIM: To establish a model of mouse embryonic stem cell test (EST) to examine the toxic effect of 5-fluorouracil (5-FU),diphenylhydantoin (DPH) and penicillin G on embryonic stem cells and to confirm the validity of the model for detecting the embryotoxicity of drugs.METHODSMouse embryonic stem cells were cultured and identified by the methods of morphology,karyotype analysis and alkaline phosphatase staining.The cytotoxic effect of 5-FU,DHP and penicillin G were detected by MTT assay.The effects of 5-FU,DHP and penicillin G onSox-2 gene expression were determined by semi-quantitative RT-PCR.RESULTSEST model was successfully established.As the same as the clinical toxicities of the 3 drugs,the embryotoxicity of 5-Fu was strong,that of DPH was weak and no embryotoxicity of penicillin G was observed.With the increase in the concentrations of the drugs,Sox-2 gene expression was gradually higher than that in negative control cells,but still lower than that in undifferentiated ES cells.CONCLUSIONThe established EST model can be effectively used for preliminary evaluation of the embryotoxicity of drugs.

Models,mouse embryonic stem cells; Embryotoxicity; Validity; Genes,Sox-2

1000-4718(2011)05-0985-06

R991

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.029

2010-10-20

2011-03-09

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30973602)；廣州市科技計劃資助項目(No.2010Y1-C851)；國家重大新藥創(chuàng)制項目(No.2009ZX09103-749)

△ 通訊作者 Tel：020-85220850； E-mail: huax-mail@163.com