鄭 冬， 袁 梅， 李 娟， 谷景立， 盧 博， 劉俊茹， 黃蓓暉

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

硼替佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞乙酰肝素酶表達(dá)及遷移能力的影響*

鄭 冬△， 袁 梅， 李 娟， 谷景立， 盧 博， 劉俊茹， 黃蓓暉

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

目的： 研究硼替佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266的乙酰肝素酶(HPA)表達(dá)及遷移能力的影響，并探討其作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)U266細(xì)胞，以不同濃度的硼替佐米進(jìn)行處理，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，用RT-PCR方法檢測(cè)HPA mRNA水平的變化，用Western blotting方法檢測(cè)HPA蛋白及IκB表達(dá)水平的變化，以Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果U266細(xì)胞表達(dá)HPA，以0、3.125、12.5及50 nmol/L濃度的硼替佐米處理U266細(xì)胞48 h，HPA mRNA及蛋白的表達(dá)逐漸減少(Plt;0.01)，而細(xì)胞遷移能力逐漸減弱(Plt;0.01)。同時(shí)，HPA的蛋白表達(dá)水平與IκB的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(Plt;0.01)。結(jié)論硼替佐米通過(guò)抑制HPA的表達(dá)抑制骨髓瘤細(xì)胞的遷移能力，其機(jī)制可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)途徑進(jìn)行調(diào)控的。

硼替佐米； 多發(fā)性骨髓瘤； 乙酰肝素酶； 細(xì)胞遷移

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性漿細(xì)胞增殖性疾病，在血液腫瘤性疾病中占10％。新藥硼替佐米近年來(lái)在MM的治療取得了重大突破，使骨髓瘤患者的療效有了明顯改善[1]。已知曉乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的葡萄糖醛酸酯酶[2]，研究發(fā)現(xiàn)，HPA在MM的患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，且表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān)[3-5]。硼替佐米是否同樣能影響骨髓瘤細(xì)胞HPA的表達(dá)，進(jìn)而減弱其遷移能力，從而抑制骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，尚有待進(jìn)一步研究。本研究探討了硼替佐米對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株U266的HPA表達(dá)及遷移能力的影響，期望發(fā)現(xiàn)硼替佐米作用于骨髓瘤細(xì)胞的新途徑。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞和試劑

人MM細(xì)胞系U266由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈(zèng)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所，Trizol 試劑購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq 酶購(gòu)自Toyobo公司，PCR 引物由TaKaRa公司合成，HPA兔抗人多克隆抗體及IκB兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz，GAPDH兔抗人單克隆抗體及羊抗IgG/HRPⅡ抗購(gòu)自博奧申公司，Transwell板(8 μm孔徑)購(gòu)于Corning。

2細(xì)胞培養(yǎng)

用含10％的胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3藥物干預(yù)

硼替佐米粉劑溶解于生理鹽水中，將其濃度配置為100 μmol/L(母液)，使用RPMI-1640培養(yǎng)基將其稀釋成終濃度為：3.125、6.25、12.5、25、50 nmol/L，未加入硼替佐米藥物的即為對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

將收集的細(xì)胞稀釋為6×107cells/L，分別接種50 μL于96孔板中，3×104cells/well，每孔分別加入配置好的不同濃度的硼替佐米(0、3.125、6.25、12.5、25、50 nmol/L) 50 μL，將孔板置于5％CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中作用不同時(shí)間(12、24、36、48、60 h)。將處理好的細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，再置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值。

5RT-PCR檢測(cè)HPAmRNA

細(xì)胞檢測(cè)前的藥物干預(yù)方法同上，只是將培養(yǎng)板改換為6孔板，接種5×106個(gè)細(xì)胞。HPA上游引物： 5′-GAATGGCCCTACCAGGAGCA -3′，下游引物5′-AACGCATTTAGGCCAAAGATCAAG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為145 bp；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3′,下游引物5′- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為138 bp。

總RNA的提取按RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其260 nm和280 nm處吸光度(A)值，選取A260/A280比值為1.8-2.0者，以A計(jì)算出濃度。反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min；96 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(內(nèi)參照GAPDH只進(jìn)行了30個(gè)循環(huán))；72 ℃延長(zhǎng)7 min。反應(yīng)體系為25 μL。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL上樣于1.5 ％瓊脂糖(含0.5 g/L的溴化乙錠)，于100 V電壓下電泳25 min，然后將凝膠放入凝膠電泳成像儀，在紫外光下觀察結(jié)果并行灰度分析。

6Westernbloting檢測(cè)HPA及IκB蛋白的表達(dá)

提取總蛋白前的細(xì)胞藥物干預(yù)與提取RNA前處理一致，加入RIPA裂解液及使用超聲細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白濃度后，定量，變性。選擇9 ％的分離膠及3.75％的濃縮膠，上樣、電泳后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用含5％脫脂奶的1×TBST室溫封閉膜1 h，加入HPAⅠ抗(1∶600)，4 ℃孵育過(guò)夜，搖床輕搖，第2 d洗膜，然后加入Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光液反應(yīng)數(shù)分鐘，使用Kodak 膠卷壓片，曝光，顯影，定影。然后將膜取出，用Stripping Buffer(Pierce)洗脫后重復(fù)上述封閉步驟，加入IκBⅠ抗(1∶800)，后同上顯影后，再加入內(nèi)參照GAPDH(1∶2 500)，顯影。用Quantity One(Bio-Rad)進(jìn)行灰度分析。

7Transwell細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)用24孔Transwell板，其孔徑為8 μm。照前述用不同濃度的硼替佐米(3.125、12.5、50 nmol/L)作用細(xì)胞40 h后用于實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109cells/L，Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板上室中加入200 μL U266細(xì)胞懸液，下室中加入含有趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)和不同濃度的硼替佐米600 μL，RPMI-1640培養(yǎng)液作用細(xì)胞為對(duì)照，細(xì)胞在5％CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，用細(xì)胞收集器仔細(xì)收集由上室進(jìn)入下室的U266細(xì)胞，然后使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1U266細(xì)胞中HPA的表達(dá)情況

在未給予任何干預(yù)處理下，HPA mRNA及蛋白在骨髓瘤細(xì)胞株U266的表達(dá)見(jiàn)圖1。

2硼替佐米對(duì)U266細(xì)胞活性的影響

硼替佐米可抑制U266細(xì)胞生長(zhǎng)，且呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，如圖2，硼替佐米作用U266細(xì)胞48 h后IC50為8.853 nmol/L。

Figure 1.The expression of HPA mRNA and protein in U266 cells detected by RT-PCR(A) and Western blotting(B),respectively.M:marker;Lane 1-3 :U266 cells.

Figure 2.Cell viability of U266 cells after treated with different concentrations of bortezomib detected by CCK-8 .±s.n=3.

3硼替佐米對(duì)HPAmRNA表達(dá)水平的影響

由圖3可以看出，隨著硼替佐米藥物濃度的增加，U266細(xì)胞內(nèi)HPA mRNA表達(dá)量逐漸減少(均Plt;0.01)。

4硼替佐米對(duì)HPA和IκB蛋白表達(dá)水平的影響

由圖4可以看出，隨著硼替佐米藥物濃度的增加，IκB蛋白的表達(dá)水平逐步增加，而HPA蛋白表達(dá)量逐漸減少。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，HPA蛋白的表達(dá)水平與IκB蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.904，Plt;0.01)。

5硼替佐米對(duì)U266細(xì)胞遷移能力的影響

由于Transwell下室中加入了含趨化因子的胎牛血清，故細(xì)胞在趨化因子的作用下由上室遷移至下室，因硼替佐米的作用濃度不同，最終進(jìn)入下室的U266細(xì)胞數(shù)不同。隨著硼替佐米藥物濃度的增加(0、3.125、12.5、50 nmol/L)，遷移入下室的U266細(xì)胞數(shù)逐漸減少，進(jìn)入下室的細(xì)胞分別為：(1.350±0.079)×104個(gè)、(1.230±0.088)×104個(gè)、(0.830±0.068)×104個(gè)、(0.630±0.096)×104個(gè)，經(jīng)方差分析顯示，通過(guò)不同濃度的硼替佐米處理過(guò)的U266細(xì)胞，其遷移能力在總體上是有差異的(Plt;0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，HPA的表達(dá)與U266細(xì)胞遷移能力呈負(fù)相關(guān)(r=0.85，Plt;0.01)。

Figure 3.The expression of HPA mRNA in U266 cells treated with different concentrations of bortezomib for 48 h detected by RT-PCR.M:marker;lane 1-4:0,3.125,12.5 and 50 nmol/L bortezomib,respectively.±s.n=3.**Plt;0.01 vs lane 1.

Figure 4. The expression of HPA and IκB proteins in U266 cells treated with different concentrations of bortezomib for 48 h detected by Western blotting.Lane 1-4:0,3.125,12.5 and 50 nmol/L bortezomib,respectively±s.n=3.**Plt;0.01 vs lane 1.

討 論

MM是漿細(xì)胞克隆性增殖的惡性腫瘤，侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，隨著對(duì)MM發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了許多新藥抗MM侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了通過(guò)抑制某些因子或轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可降低MM細(xì)胞的遷移。

HPA是一種內(nèi)切糖苷酶，為內(nèi)源性β葡萄醛酸酯酶，通過(guò)對(duì)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulphate proteoglycans，HSPG)的特異性降解，改變細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，促使各種炎癥細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的游走轉(zhuǎn)移，同時(shí)釋放多個(gè)具有生物學(xué)活性的硫酸乙酰肝素鏈(heparan sulfate，HS)片段以及與HS結(jié)合的各種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，從而促進(jìn)血管的生成[2]。目前已證實(shí)，與正常組織相比，腫瘤組織優(yōu)先表達(dá)HPA，并且與許多腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，影響著腫瘤的預(yù)后[6-8]。在MM中，Kelly等[3]及Mahtouk等[4]發(fā)現(xiàn)HPA在MM患者骨髓中呈現(xiàn)高表達(dá)，Yang等[5]發(fā)現(xiàn)HPA基因轉(zhuǎn)染的MM細(xì)胞的增殖和侵襲力上升，皮下注射可轉(zhuǎn)移至脾、肝、肺和骨，骨內(nèi)注射選擇性地轉(zhuǎn)移至其它骨頭。

硼替佐米是首個(gè)應(yīng)用于臨床治療難治復(fù)發(fā)MM的蛋白酶體抑制劑[9]，通過(guò)抑制蛋白酶體26S亞基的活性，減少NF-κB的抑制因子(IκB)的降解，阻斷NF-κB信號(hào)途徑，從而抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖及減少生長(zhǎng)因子的分泌和黏附因子的表達(dá)，達(dá)到治療的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，MM細(xì)胞株U266表達(dá)HPA，并隨著硼替佐米藥物濃度的增加，HPA mRNA及蛋白表達(dá)水平逐漸減少，MM細(xì)胞的遷移能力逐步減弱，HPA的表達(dá)水平與MM細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)。

因此，我們推測(cè)硼替佐米減弱MM細(xì)胞遷移的能力，其作用途徑之一是通過(guò)調(diào)節(jié)HPA的表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。HPA表達(dá)水平的減低可減少激活及釋放細(xì)胞因子，也可減少可溶性CD138的形成。而可溶性CD138被認(rèn)為是促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移的物質(zhì)[10,11]，并能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達(dá)[12]。由此推測(cè)，HPA表達(dá)水平的減低，減弱了骨髓瘤細(xì)胞的游走能力，增強(qiáng)了黏附性，從而降低了骨髓瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，硼替佐米抑制MM細(xì)胞HPA的表達(dá)，其中HPA蛋白的表達(dá)水平與IκB的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。是否NF-κB信號(hào)途徑的阻斷抑制了HPA 的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響蛋白翻譯，尚需進(jìn)一步研究。但Andela等[13]通過(guò)轉(zhuǎn)染無(wú)磷酸化功能的IκB載體入小鼠肺泡細(xì)胞，阻斷NF-κB信號(hào)通路，可下調(diào)HPA、MMP-9等促轉(zhuǎn)移蛋白物質(zhì)的表達(dá)?？傊?，目前對(duì)于HPA的直接調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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Effectofbortezomibonheparanaseexpressionandmigrationabilityofmultiplemyelomacells

ZHENG Dong,YUAN Mei,LI Juan,GU Jing-li,LU Bo,LIU Jun-ru,HUANG Bei-hui

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zcxzd@tom.com)

AIM: To study the effects of bortezomib on heparanase (HPA) expression and migration ability of multiple myeloma cell line U266.METHODSThe U266 cells were cultured with different concentrations of bortezomibinvitro.CCK-8 assay was used to determine the cell viability.The mRNA expression of HPA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The protein levels of HPA and IκB were determined by Western blotting.The migration ability of the cells was investigated by Transwell assay.RESULTSHPA was expressed in U266 cells.After treated with bortezomib at the concentrations of 0,3.125,and 12.5 and 50.0 nmol/L for 48 h,the expression of HPA at mRNA and protein levels was gradually reduced (Plt;0.01),and the migration ability of U266 cells was also gradually decreased (Plt;0.01).At the same time,the level of IκB expression negatively correlated with that of HPA expression (Plt;0.01).CONCLUSIONBortezomib inhibits the migration ability of multiple myeloma cell line U266 by suppressing the HPA expression through NF-κB signaling pathway.

Bortezomib; Multiple myeloma; Heparanase; Cell migration

1000-4718(2011)05-0865-04

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.007

2011-03-10

2011-04-28

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2005B30301006)

△通訊作者 Tel：020-87755766-8831;E-mail：zcxzd@tom.com