侯俊娜, 羅益鋒, 王杜娟, 楊惠玲， 郭禹標△

(中山大學 1附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 2中山醫(yī)學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510080)

siRNA 沉默MIF基因抑制大細胞肺癌H460細胞增殖*

侯俊娜1, 羅益鋒1, 王杜娟2, 楊惠玲2， 郭禹標1△

(中山大學1附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2中山醫(yī)學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510080)

目的： 研究小干擾RNA(siRNA)阻斷巨噬細胞抑制因子(MIF)基因表達對大細胞肺癌細胞株H460細胞增殖的抑制效應(yīng)并探討其抑瘤機制。方法在體外培養(yǎng)的H460細胞中，采用免疫熒光法觀測siRNA轉(zhuǎn)染效率，Western blotting檢測MIF蛋白的表達，MTT法和平板克隆形成實驗檢測 MIF siRNA對H460細胞活性和增殖的抑制作用，Hoechst染色出現(xiàn)后熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染后細胞的形態(tài)學變化，流式細胞儀觀測細胞凋亡。結(jié)果與陰性對照組相比，siRNA能有效阻斷MIF蛋白的表達，顯著抑制H460細胞活性及增殖能力(Plt;0.05)；Hoechst染色可見轉(zhuǎn)染MIF siRNA后的H460細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染MIF siRNA1和MIF siRNA2后細胞凋亡較陰性對照組顯著增加[ (18.09±0.41)％ 和(23.38±2.67)％vs(5.87±1.05)％，Plt;0.05]。結(jié)論MIF在大細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，siRNA阻斷MIF蛋白表達，可抑制H460細胞增殖，提示其極有可能成為肺癌的新治療靶點。

巨噬細胞抑制因子； 小干擾RNA； 肺腫瘤

肺癌為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，半個世紀以來世界各國肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯增高的趨勢。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，其中NSCLC占80％以上。NSCLC早期侵犯血管，易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，且多數(shù)NSCLC對放化療并不敏感，尋找新的診療方法迫在眉睫[1,2]。在多數(shù)腫瘤可見負調(diào)控因子的表達或功能異常，設(shè)法拮抗異常的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、提高負調(diào)控因子或沉默正調(diào)控因子，使其達到新的平衡，是治療肺癌的新策略[3]。目前認為，巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一種獨特的促進惡性腫瘤發(fā)生的細胞因子。MIF不僅作為重要的炎癥細胞因子參與機體的炎癥及免疫反應(yīng)，而且和細胞增殖、細胞分化及腫瘤血管生成等關(guān)鍵環(huán)節(jié)密切相關(guān)[4-7]。還有研究證明，靶向沉默MIF基因后，肺腺癌A549細胞的侵襲與遷移能力下降90％，若MIF過表達，則可觀察到相反現(xiàn)象[7]。在NSCLC其它類型如大細胞肺癌中是否存在MIF表達及相關(guān)的作用，國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)技術(shù)阻斷MIF蛋白的表達，觀察其對人大細胞肺癌H460細胞增殖的影響并探討其可能機制,為研發(fā)NSCLC的新治療靶點提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

H460細胞株由中山大學實驗動物中心提供。Lipofectamine 2000購自Invitrogen。MIF的siRNA序列由Invitrogen合成，MIF siRNA1: 正義鏈5′-AUAGUUGAUGUAGACCCUGUCCGGG-3′,反義鏈5′-CCCGGACAGGGUCUACAUCAACUAU-3′; MIF siRNA2:正義鏈5′- UUGGUGUUUACGAUGAACAUCGGCA-3′,反義鏈5′-UGCCGAUGUUCAUCGUAAACACCAA-3′; Opti-MEM培養(yǎng)基、BLOCK-iT Alexa Fluor Red Oligo和Stealth RNAi Negative Control Hi GC Kit均購自Invitrogen。MIF鼠抗人單克隆抗體購自Abcam，HRP標記的羊抗小鼠IgG(Ⅱ抗)購自Cell Signaling Technology。噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiahiazol-2-y1)-3,5-diphenyltetrazoliumromide,MTT]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)為Sigma產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品；小牛血清為杭州四季青產(chǎn)品。Leica DMI4000B 智能型倒置熒光顯微鏡購自Leica。Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物；ECL發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；流式細胞儀購自BD。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) H460細胞株采用含10％小牛血清、無抗生素的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，置37 ℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。轉(zhuǎn)染前24 h消化細胞，傳代于6孔板，第2 d按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。分別用Opti-MEM稀釋siRNA及脂質(zhì)體，室溫靜置5 min后混和，室溫孵育20 min，轉(zhuǎn)染細胞。實驗分為陰性對照組(轉(zhuǎn)染negative control siRNA，NC siRNA)和實驗組(分別轉(zhuǎn)染MIF siRNA1和MIF siRNA2)。

2.2免疫熒光法觀測siRNA轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染前24 h 消化細胞，傳代于6孔板，第2 d按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，按照濃度梯度加入熒光標記的siRNA,熒光siRNA轉(zhuǎn)染H460細胞，6 h后PBS沖洗1次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3Western blotting法測定目的蛋白MIF的表達 轉(zhuǎn)染后48 h，收集全細胞蛋白標本，常規(guī)BCA方法蛋白定量。制備15％聚丙烯酰胺凝膠，進行SDS-PAGE電泳(2-3 h)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(50 min)，室溫5％BSA封閉1 h，加MIF Ⅰ 抗(1∶750)孵育PVDF膜4 ℃過夜，后TBST洗膜3次,加HRP偶聯(lián)的Ⅱ 抗(1∶2 000)，孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色曝光,Qantity One 軟件分析結(jié)果。

2.4MTT法測定細胞活性 胰酶消化對數(shù)生長期細胞，以每孔5×103細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作轉(zhuǎn)染siRNA，使液體終體積100 μL/well，每組設(shè)4個復(fù)孔，6 h后每孔加入含20％小牛血清、無抗生素RPMI-1640細胞培養(yǎng)基100 μL/well，孵育0、24、48、72 h后，棄去培養(yǎng)液，加入MTT溶液(20 μL/well)培養(yǎng)4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150 μL/well)，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解，酶聯(lián)免疫檢測490 nm處測量其吸光度值(A值)。

2.5平板克隆實驗檢測細胞增殖能力 siRNA轉(zhuǎn)染細胞24 h后，胰酶消化細胞，以200 cells/well接種于6孔板，加全培養(yǎng)基2 mL/well繼續(xù)培養(yǎng)10 d,常規(guī)固定染色，顯微鏡下計數(shù)集落，以≥50個細胞作為一個集落，并計算克隆形成率。

克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100％

2.6Hoechst染色法觀察細胞形態(tài)學變化 胰酶消化細胞，按1.5×105cells/well接種于6孔板，第2 d轉(zhuǎn)染，6 h后換液，48 h后棄上清，PBS洗滌2次，常規(guī)固定，Hoechst 33342染色(0.3 mL/well)，染色10 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7流式細胞儀檢測細胞凋亡率 轉(zhuǎn)染48 h后棄上清，無EDTA胰酶消化收集細胞，用膜聯(lián)蛋白(Annexin V)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)(Annexin V/PI)雙染法檢測細胞凋亡率。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1免疫熒光法觀測轉(zhuǎn)染效率

免疫熒光結(jié)果表明，siRNA的成功轉(zhuǎn)染效率可達70％以上，但是在siRNA濃度≥50 nmol/L后，隨著siRNA濃度的增加，轉(zhuǎn)染效率沒有表現(xiàn)出相應(yīng)的劑量依賴關(guān)系，因此我們選擇50 nmol/L的濃度做后續(xù)功能研究實驗,見圖1。

Figure 1.The transfection efficiency of siRNA directed against MIF was assessed by immunofluorescence technique.A: 50 nmol/L siRNA; B: 100 nmol/L siRNA.

2Westernblotting檢測靶向沉默MIF基因后，H460細胞中MIF蛋白的表達

與NC siRNA組相比，MIF siRNA1和MIF siRNA2均能有效阻斷MIF蛋白的表達,見圖2。

3靶向沉默MIF基因?qū)460細胞活性及增殖的影響

MTT結(jié)果表明，H460細胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，與NC siRNA組相比，MIF siRNA能顯著抑制H460細胞的活性，差異顯著(Plt;0.05)，見表1。平板克隆實驗結(jié)果顯示，MIF siRNA1和MIF siRNA2組細胞克隆形成率分別為(32.00±4.44)％、(22.00±3.46)％，顯著低于NC組細胞克隆形成率(66.67±2.56)％，差異顯著(Plt;0.05),見圖3。

4MIFsiRNA對H460細胞凋亡的影響

4.1電鏡形態(tài)學觀察 Hoechest 33342染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，與NC組細胞相比，可見MIF siRNA1組和MIF siRNA2組細胞數(shù)減少，并且可見染色質(zhì)濃縮、碎裂和邊集，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學改變,見圖4。

4.2細胞凋亡的流式檢測 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后H460細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，NC組凋亡率為5.87％，MIFsiRNA1和MIFsiRNA2組凋亡率分別為18.09％、23.38％。差異顯著(Plt;0.05)，見圖5。

Figure 2.Expression of MIF protein detected by Western blotting in H460 cells after knockdown of MIF gene by siRNA.NC: negative control±s.n=3.*P lt;0.05 vs NC group.

表1 MTT法檢測MIF siRNA對H460細胞活性影響

Figure 3.The proliferation of H460 cell induced by MIF siRNA.A: negative control group; B: MIF siRNA1 group ；C: MIF siRNA2 group.

Figure 4.The morphological character of apoptosis in H460 cell induced by MIF-siRNA was detected by Hoechst 33342.A: negative control group;B: MIF siRNA1 group;C:MIF siRNA2 group.

Figure 5.The apoptosis of H460 cell line after treatment with MIF siRNA for 48 h.±s.n=3.A: negative control group(5.87±1.05)％; B: MIF siRNA1 group(18.09±0.41)％*；C: MIF siRNA2 group(23.38±2.67)％*#.*Plt;0.05 vs negative control group;#Plt;0.05 vs MIF siRNA1 group.

討 論

MIF是一個相對分子量為12.5 kD的非糖基化蛋白，最初它作為激活的T淋巴細胞產(chǎn)生的一種可溶性淋巴因子被發(fā)現(xiàn)，認為其有抑制巨噬細胞遷移作用。后來進一步研究表明，它在炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前認為，巨噬細胞移動抑制因子是一種獨特的促進惡性腫瘤發(fā)生的細胞因子。MIF在多種腫瘤如肝癌﹑結(jié)腸癌、肺腺癌﹑乳腺癌﹑膀胱癌、前列腺癌、神經(jīng)母細胞瘤及慢性粒細胞白血病等腫瘤細胞過度表達[4-11]。

已有多項研究發(fā)現(xiàn)，MIF參與了肺癌特別是NSCLC的發(fā)生和發(fā)展，Khan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC病人的血清MIF和血清淀粉樣蛋白-A(SAA)水平明顯增高，提示MIF可作為腫瘤生物標志物檢測早期肺癌；Kamimura等[12]通過免疫組化/原位雜交發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌病人的肺組織MIF過度表達且與預(yù)后明確相關(guān)；White 等[13]研究表明：NSCLC肺癌組織標本高表達MIF與血中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和肺癌組織CXC趨化因子(CXC chemokine)表達升高呈正相關(guān)，特別是與腫瘤組織微血管密度(mierovascular density,MVD)呈顯著正相關(guān)。McClelland等[14]進一步發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織標本中特異的MIF受體-CD74表達同樣顯著增高且誘導(dǎo)體內(nèi)外促血管新生的CXC趨化因子表達升高;MIF這種誘導(dǎo)血管新生效應(yīng)可被CD74抗體所拮抗。上述結(jié)果均提示MIF與NSCLC血管生成和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。至于肺癌細胞自分泌或旁分泌MIF究竟如何參與控制腫瘤細胞增殖、遷移以及促進血管生成，其信號通道與分子機制目前尚不清楚，我們在國內(nèi)首次用siRNA阻斷或減少MIF蛋白表達，探討研究其抑瘤作用，對尋求治療肺癌的新途徑和新治療靶點具有重要意義。

大量研究表明，MIF通過抑制抑癌基因p53的功能、持續(xù)激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)/ 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)/前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)激活、促進血管內(nèi)皮細胞的增殖及分化等獨特的生物學作用多層次促進腫瘤的生長、增殖及侵襲[15]；并且在低分化腫瘤中，MIF表達與預(yù)后相關(guān)[16]，提示MIF與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，但具體的分子機制尚未完全闡明。Jung 等[9]研究表明，MIF阻止P53從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，并且可抑制P53的活性，抑制細胞增殖、促進凋亡。Binsky等[10]在慢性淋巴細胞白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，MIF表達明顯升高，通過激活I(lǐng)L-8，繼而Bcl-2表達增加，抑制腫瘤細胞凋亡，促進細胞增殖。Arenberg 等[17]發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6小鼠肺損傷急性期，MIF表達增加，抑制在急性期注入小鼠體內(nèi)的Louis癌細胞的凋亡，促進其增殖，而在敲除MIF基因的小鼠中則無此現(xiàn)象。

我們的研究結(jié)果表明：大細胞肺癌H460細胞株高表達MIF蛋白，體外應(yīng)用siRNA靶向沉默MIF基因后，H460細胞的活性、增殖能力下降；繼而用Annexin V - FITC/ PI 雙染色凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染MIF siRNA部分阻斷MIF表達后，H460細胞凋亡率顯著增加，與之前Jung等[9]的研究結(jié)果相似，為MIF在人類惡性腫瘤特別是NSCLC中發(fā)揮著重要作用提供了更豐富的證據(jù)。

我們的研究首次證實在大細胞肺癌的生長、進展過程中，MIF可能通過促進細胞凋亡抑制腫瘤細胞的增殖，這也為研發(fā)大細胞肺癌新的治療靶點提供了重要的實驗依據(jù)，并且研究過程中所用的MIF siRNA也可能成為有效的抗癌藥物。但是，目前關(guān)于MIF siRNA 促進細胞凋亡、抑制細胞增殖的具體信號通道與分子生物學機制尚不明了，基于之前國內(nèi)外學者的大量研究，我們審慎地推測:MIF作為一種促炎、促癌的細胞因子，廣泛參與非小細胞肺癌的各種細胞生物學行為，介導(dǎo)不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的交互對話(crosstalk)，從而協(xié)同促進非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，當然這尚需要更完善的體內(nèi)外實驗來驗證。通過特異的MIF siRNA阻斷MIF表達，檢測凋亡和增殖相關(guān)的上、下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，進一步探討其可能的體內(nèi)外抑癌機制，本課題組正在進行深入研究。

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血管鈣化轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究進展研討會第一輪通知

血管鈣化是動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎衰的常見并發(fā)癥，與上述疾病的心血管事件發(fā)生率和死亡率密切相關(guān)。為促進國內(nèi)血管鈣化領(lǐng)域臨床工作者和基礎(chǔ)科研人員的深入交流與廣泛合作，提升我國在血管鈣化領(lǐng)域的國際學術(shù)影響力，凝練血管鈣化的轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究隊伍，由教育部分子心血管重點實驗室、北京大學醫(yī)學部生理與病理生理系、附屬北醫(yī)三院和人民醫(yī)院、《生理科學進展》雜志、中日友好醫(yī)院聯(lián)合主辦，茲定于2011年8月27日在北京大學醫(yī)學部召開首屆血管鈣化轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究進展研討會，就血管鈣化的臨床流行病學、發(fā)病機制、診治及預(yù)后等熱點問題進行為期一天的探討與交流。會議邀請了國內(nèi)該領(lǐng)域知名專家與會作專題報告，歡迎從事臨床、基礎(chǔ)、預(yù)防和藥學工作對血管鈣化感興趣的學者踴躍參會。

會議無需注冊費。26號下午和27號早8點前報到，報名者請于6月1日之前將回執(zhí)發(fā)至kongfanwei2000@gmail.com,由大會主席批準后確認參會名單。會議征集500字論文摘要，內(nèi)容涉及血管鈣化相關(guān)臨床流行病學、診斷、發(fā)病機制、治療等方面，請于7月15日之前提交至kongfanwei2000@gmail.com。

會 議 主 席： 唐朝樞 教授，王 憲 教授

會議籌備組： 王 悅 教授，王 梅 教授，齊永芬 教授，孔 煒 教授

會議聯(lián)系人： 孔 煒 教授

電 話： 010-82805594

InhibitionofhumanlungcarcinomaH460cellproliferationbysiRNA-mediatedMIFknockdown

HOU Jun-na1,LUO Yi-feng1,WANG Du-juan2,YANG Hui-ling2,GUO Yu-biao1

(1DepartmentofPulmonaryandCriticalCareMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:guoyubiao@hotmail.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of siRNA-mediated MIF knockdown on the proliferation of human lung carcinoma H460 cells and to elucidate the molecular mechanism of anti-tumor effect of the siRNA.METHODSThe transfection efficiency was assessed by immunofluorescence technique.The expression of MIF after the gene knockdown was determined by Western blotting.The viability and proliferation of H460 cancer cells were detected by MTT assay and colony formation assay,respectively.The cell apoptosis and morphological changes were examined by flow cytometry and electron microscopy,respectively.RESULTSMIF siRNA significantly inhibited MIF expression in H460 cells,and decreased the proliferation of the cells(Plt;0.05).The morphological changes were detected in the nuclei of H460 cells induced by MIF siRNA.The apoptotic rates were much higher in the groups of MIF siRNA1 and MIF siRNA2 than that in negative control group[(18.09±0.41)％ and(23.38±2.67)％vs(5.87±1.05)％,Plt;0.05].CONCLUSIONMIF might play an important role in the pathogenesis and progression of large cell lung cancer.siRNA-mediated knockdown of MIF results in the inhibition of H460 cell proliferation,indicating that MIF might be used as a potential therapeutic target in lung cancer.

Macrophage migration inhibitory factor; Small interference RNA; Lung neoplasms

1000-4718(2011)05-0853-06

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.005

2010-12-20

2011-03-07

廣東省自然科學基金資助項目(No.10151008901000242)；2010年廣東省科技計劃資助項目(No.2010B080701010)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8132; E-mail: guoyubiao@hotmail.com