陳俊榕， 李初俊△， 楊惠玲， 張君孝， 王蘇美， 朱穎鈺， 葉曉丹

(1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院,廣東 廣州 510655;2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,廣東 廣州 510080)

結(jié)直腸腺瘤及癌變組織CHOP蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究*

陳俊榕1， 李初俊1△， 楊惠玲2， 張君孝1， 王蘇美2， 朱穎鈺1， 葉曉丹1

(1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院,廣東 廣州 510655;2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,廣東 廣州 510080)

目的： 檢測(cè)和探討結(jié)直腸腺瘤及癌變組織C/EBP同源蛋白(CHOP)表達(dá)和細(xì)胞凋亡及其與臨床病理的關(guān)系，并分析CHOP與細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)SABC法和原位末端標(biāo)記法分別檢測(cè)59 例正常腸黏膜、67 例結(jié)直腸腺瘤和56 例結(jié)直腸腺癌組織CHOP表達(dá)及細(xì)胞凋亡。結(jié)果CHOP在伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤和腺癌組織陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常腸黏膜和早期腺瘤(Plt;0.05)，且與腺瘤大小、病理類型和腸癌大小、浸潤(rùn)深度相關(guān)(Plt;0.05)；伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤和腺癌組織AI顯著高于正常腸黏膜和早期腺瘤(Plt;0.05)，AI與腺瘤大小、病理類型和腸癌大小有關(guān)(Plt;0.05)；伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤和腺癌組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)者AI顯著高于陰性表達(dá)者(Plt;0.05)，在具有某相同臨床病理特征的腺瘤和腸癌組織中CHOP陽(yáng)性表達(dá)者AI顯著高于CHOP陰性表達(dá)者(Plt;0.05)。結(jié)論CHOP和細(xì)胞凋亡異常共同參與結(jié)直腸腺瘤癌變，CHOP表達(dá)與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，CHOP可能通過(guò)促細(xì)胞凋亡介導(dǎo)腺瘤癌變。

結(jié)直腸腫瘤； C/EBP同源蛋白質(zhì)； 細(xì)胞凋亡

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人民生活水平不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)發(fā)病率逐年上升，目前我國(guó)部分地區(qū)CRC發(fā)病率和死亡率已達(dá)到發(fā)達(dá)國(guó)家水平。研究表明CRC主要起源于腺瘤[1]，該過(guò)程伴隨癌基因和抑癌基因的突變，且與高脂飲食等密切相關(guān)；但由于其機(jī)制尚未完全闡明，CRC早期診斷困難，過(guò)半數(shù)患者確診時(shí)癌細(xì)胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。因此，進(jìn)一步研討和闡明結(jié)直腸腺瘤癌變機(jī)制，確立CRC早預(yù)測(cè)、早診斷和早治療的新方法，對(duì)保障我國(guó)社會(huì)主義現(xiàn)代化建設(shè)的順利進(jìn)行具有重要的戰(zhàn)略意義。細(xì)胞凋亡和增殖異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。近年發(fā)現(xiàn)的除傳統(tǒng)的線粒體和死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑外，新的細(xì)胞凋亡調(diào)控途徑-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可在缺氧等病理?xiàng)l件下被激活，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄上調(diào)其特異轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)[3]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)ERS參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、治療及預(yù)后，如反義葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78)基因可抑制乳腺癌細(xì)胞231細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]；轉(zhuǎn)染CHOP基因可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加胃癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥的敏感性[5]。目前ERS與CRC的研究主要集中在細(xì)胞水平，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)ERS與結(jié)直腸腺瘤癌變的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SABC法和原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling method,TUNEL)分別檢測(cè)59 例正常腸黏膜、67 例結(jié)直腸腺瘤和56 例結(jié)直腸腺癌組織ERS關(guān)鍵蛋白CHOP表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，并探討CHOP表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)的關(guān)系，旨在探明CHOP介導(dǎo)結(jié)直腸腺瘤癌變的確切作用，為下一步研究ERS介導(dǎo)結(jié)直腸腺瘤癌變作用及機(jī)制提供依據(jù)，也有望為CRC預(yù)測(cè)和早診新方法的確立提供新思路。

材 料 和 方 法

1材料

收集中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心2009 年1 月至12 月電子結(jié)腸鏡下全瘤切除的結(jié)直腸腺瘤組織標(biāo)本67 例，其中男37 例，女30 例；年齡26-81歲，平均年齡53.7歲；腺瘤直徑lt;1 cm者26例，≥1 cm者41 例；參照WHO新分類標(biāo)準(zhǔn)[6]，分類分別為管狀腺瘤30 例，絨毛狀腺瘤37 例；早期腺瘤38 例，腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變16 例，腺瘤伴惡變13 例(早期腺瘤：指伴輕、中度異型增生的腺瘤；腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變：包括伴重度異型增生的腺瘤、原位癌和黏膜內(nèi)癌)；無(wú)蒂腺瘤22 例，有蒂腺瘤45 例。收集中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院病理科同期外科手術(shù)標(biāo)本結(jié)直腸腺癌56 例(患者術(shù)前均未接受放療和化療)，其中男30 例，女26 例；年齡30-80歲，平均年齡56歲；腫瘤直徑lt;3 cm者15例，≥3 cm者41 例；參照WHO新分類標(biāo)準(zhǔn)[6]，分類分別為：高分化腺癌17 例，中分化腺癌31 例，低分化腺癌8 例；腫瘤浸潤(rùn)深度未及腸壁全層者11 例，已浸潤(rùn)腸壁全層者17 例，突破漿膜層遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者28 例；較早期21 例，較晚期35例(較早期腸癌：指按Duke’s分期為A期和B期的腸癌;較晚期腸癌：指按Duke’s分期為C期和D期的腸癌[6])；無(wú)腸周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26 例，有腸周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 例。另收集中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院病理科保存的同期正常腸黏膜組織標(biāo)本59 例，性別及年齡均與結(jié)直腸腺瘤和腺癌標(biāo)本匹配。所有標(biāo)本均經(jīng)10％甲醛固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，貼在涂有3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)黏附劑的載玻片上，烘箱烤干備用。HE染色病理確診。

2方法

2.1免疫組織化學(xué)SABC法 CHOP多抗(F-168：sc575)購(gòu)自Santa Cruz；SABC試劑盒(SA1022)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenizidine,DAB)顯色試劑盒(ZLI-9032)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。主要步驟包括：(1)烤片，常規(guī)脫蠟及水合；(2)枸櫞酸鹽緩沖液pH 6.0微波修復(fù)4×6 min，冷卻至室溫，蒸餾水漂洗10 min；(3)3％H2O2室溫封閉10 min，以阻斷其內(nèi)源酶，TBST漂洗10 min；(4)細(xì)胞通透30 min，TBST漂洗10 min；(5)血清封閉20 min，甩干；(6)滴加CHOPⅠ抗(工作濃度1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗10 min；(7)滴加Ⅱ抗，室溫60 min，TBST漂洗10 min；(8)滴加SABC工作液，室溫30 min，TBST漂洗10 min； (9)DAB顯色2 min，自來(lái)水漂洗；(10)蘇木素復(fù)染30 s，1％鹽酸乙醇分化3 s，自來(lái)水漂洗，脫水、透明、封片、光學(xué)顯微鏡觀察。用已知CHOP陽(yáng)性乳腺癌組織作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替CHOPⅠ抗作陰性對(duì)照。如CHOP表達(dá)陽(yáng)性，則可見(jiàn)棕黃色細(xì)顆粒狀分布于細(xì)胞核及細(xì)胞漿。根據(jù)DAB顯色結(jié)果，雙盲法光學(xué)顯微鏡觀察，參照Formwitz評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：lt;5％者計(jì)0 分，5％-24％者1 分，25％-49％者2 分，50％-74％者3 分，≥75％者4 分；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)色計(jì)0 分，淡黃色1 分，黃色2 分，棕黃色3 分。以上2項(xiàng)得分的乘積即該樣本的染色得分。根據(jù)上述得分評(píng)價(jià)樣本染色情況：≤3 分為陰性，gt;3 分為陽(yáng)性[7]。

2.2TUNEL法 根據(jù)凱基TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC標(biāo)記POD法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。主要步驟包括：(1)烤片，常規(guī)脫蠟及水合；(2)蛋白酶K21-37 ℃消化30 min，PBS漂洗10 min；(3)3％H2O215-25 ℃封閉10 min，以阻斷其內(nèi)源酶，PBS漂洗10 min；(4)滴加TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片37 ℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)60 min，PBS漂洗15 min；(5)熒光顯微鏡觀察：激發(fā)波長(zhǎng)450-500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-565 nm；(6)滴加anti-fluorescein antibody工作液，加蓋玻片37 ℃濕潤(rùn)避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗15 min；(7)DAB顯色10 min，自來(lái)水漂洗；(8)蘇木素復(fù)染30 s，1％鹽酸乙醇分化3 s，自來(lái)水漂洗，脫水、透明、封片、光學(xué)顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)。用已知陽(yáng)性肝癌組織作陽(yáng)性對(duì)照，省去TdT酶的TdT反應(yīng)液作陰性對(duì)照。熒光顯微鏡下可見(jiàn)凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞激發(fā)出綠色熒光；光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕色，連續(xù)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求出平均每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)[8]。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1結(jié)直腸腺瘤及癌變組織CHOP表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系

正常腸黏膜組織CHOP不表達(dá)或少量表達(dá)在細(xì)胞漿；PBS代替Ⅰ抗組染色呈陰性。腺瘤和腺癌組織CHOP表達(dá)明顯增加，可分布于細(xì)胞核和細(xì)胞漿,見(jiàn)圖1。早期腺瘤、伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的腺瘤、伴惡變的腺瘤和腺癌組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.79％、56.25％、69.23％和76.79％(2=56.361,Plt;0.01)。與正常腸黏膜和早期腺瘤比較，伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)率均顯著增加(Plt;0.05)，而與腺癌無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；早期腺瘤CHOP陽(yáng)性表達(dá)率與正常腸黏膜無(wú)顯著差異(Pgt;0.05),見(jiàn)表1。

Figure 1.CHOP expression detected by immunohistochemistry.A: colorectal adenocarcinomas (HE staining,×400);B: negative control(×200);C: normal colonic mucosas(×200);D: colorectal adenomas at the early stages(×200);E: adenomas with malignant transformation(×200);F: colorectal adenocarcinomas(×200).

表1 結(jié)直腸腺瘤癌變不同階段組織CHOP表達(dá)和AI

CHOP表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤的大小和病理類型有關(guān)。直徑≥1 cm的腺瘤CHOP陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于直徑lt;1 cm的腺瘤(2=9.240,Plt;0.01)；絨毛狀腺瘤CHOP陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于管狀腺瘤(2=17.854,Plt;0.01)；未發(fā)現(xiàn)CHOP表達(dá)與患者年齡、性別、腺瘤形態(tài)和腺瘤部位相關(guān)(Pgt;0.05)，見(jiàn)表2。

CHOP表達(dá)與腸癌的大小和浸潤(rùn)深度有關(guān)。直徑≥3 cm的腸癌組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于直徑lt;3 cm者(2=4.652,Plt;0.05)；與未及腸壁全層者相比，浸潤(rùn)腸壁全層和突破漿膜層的腸癌組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)率均顯著增高(2=6.601,Plt;0.05)，兩者之間無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；未發(fā)現(xiàn)CHOP表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤形態(tài)、部位、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臟器轉(zhuǎn)移、分期等相關(guān)(Pgt;0.05),見(jiàn)表3。

2結(jié)直腸腺瘤及癌變組織AI及其與臨床病理的關(guān)系

所有正常腸黏膜、腺瘤、腺癌組織均可檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。熒光顯微鏡可見(jiàn)凋亡細(xì)胞激發(fā)出綠色熒光,見(jiàn)圖2；正常腸黏膜組織可見(jiàn)極少綠色熒光點(diǎn)，陰性對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光點(diǎn)；伴惡變的腺瘤和腺癌組織綠色熒光點(diǎn)顯著增加，有時(shí)可成簇存在。光學(xué)顯微鏡可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕色，固縮成團(tuán)，聚集成環(huán)狀或碎裂，形成凋亡小體；正常腸黏膜少見(jiàn)細(xì)胞凋亡，伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的腺瘤、伴惡變的腺瘤以及腺癌組織凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)成倍增加。正常腸黏膜、早期腺瘤、腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、腺瘤伴惡變和腺癌AI分別為(0.89 ± 0.79)％、(1.61 ± 1.18)％、(3.96 ± 2.38)％、(5.84 ± 2.14)％、(5.43 ± 2.73)％；與正常腸黏膜和早期腺瘤相比，伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的腺瘤、伴惡變的腺瘤和腺癌AI顯著增加(Plt;0.05)，但三者之間無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；正常腸黏膜和早期腺瘤AI無(wú)顯著差異(Pgt;0.05),見(jiàn)表1。

Figure 2.The apoptotic index (AI) determined by TUNEL(×400).A: negative control;B: normal colonic mucosas;C: colorectal adenomas at the early stages;D: adenomas with high-grade intraepithelial neoplasia;E: adenomas with malignant transformation;F: colorectal adenocarcinomas.

表2 結(jié)直腸腺瘤組織CHOP表達(dá)或AI與臨床病理的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌組織CHOP表達(dá)或AI與臨床病理的關(guān)系

AI與結(jié)直腸腺瘤的大小和病理類型有關(guān)。直徑≥1 cm的腺瘤AI顯著高于直徑lt;1 cm的腺瘤(F=7.483，Plt;0.01)；絨毛狀腺瘤AI顯著高于管狀腺瘤(F=15.599，Plt;0.01)；未發(fā)現(xiàn)AI與患者年齡、性別、腺瘤形態(tài)和腺瘤部位相關(guān)(Pgt;0.05)，見(jiàn)表2。

AI與腸癌的大小有關(guān)。直徑≥3 cm的腸癌組織AI顯著高于直徑lt;3 cm者(F=4.859,Plt;0.05)；未發(fā)現(xiàn)AI與患者年齡、性別、腫瘤形態(tài)、部位、分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臟器轉(zhuǎn)移、分期等相關(guān)(Pgt;0.05)，見(jiàn)表3。

3結(jié)直腸腺瘤及癌變組織CHOP表達(dá)與AI的關(guān)系

伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤和腺癌組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)者AI顯著高于CHOP陰性表達(dá)者(Plt;0.05)；正常腸黏膜和早期腺瘤組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)者AI與CHOP陰性表達(dá)者之間無(wú)顯著性差異(Pgt;0.05),見(jiàn)表4。

將與CHOP表達(dá)有關(guān)的腺瘤大小和病理類型、腸癌的大小和浸潤(rùn)深度等臨床病理特征作為分組依據(jù)，分析具有某相同臨床病理特征的結(jié)直腸腺瘤和腸癌組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)者AI與CHOP陰性表達(dá)者AI之間的差異。在直徑lt;1 cm、直徑≥1 cm、管狀腺瘤和絨毛狀腺瘤等各組結(jié)直腸腺瘤組織中CHOP陽(yáng)性表達(dá)的組織AI均顯著高于CHOP陰性表達(dá)者(Plt;0.05)；在直徑lt;3 cm、直徑≥3 cm和浸潤(rùn)深度未及腸壁全層及突破漿膜層的各組腸癌組織中CHOP陽(yáng)性表達(dá)的組織AI均顯著高于CHOP陰性表達(dá)者(Plt;0.05)，侵潤(rùn)腸壁全層的腸癌組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)的組織AI明顯高于CHOP陰性表達(dá)者，但無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)，見(jiàn)表4。

表4 結(jié)直腸腺瘤癌變不同階段組織CHOP表達(dá)與AI的關(guān)系

表5 具有某相同臨床病理特征的結(jié)直腸腺瘤及腸癌組織CHOP表達(dá)與AI的關(guān)系

討 論

ERS是最新提出的有別于由死亡受體和線粒體介導(dǎo)的傳統(tǒng)細(xì)胞凋亡途徑之外的第3條重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控途徑，缺氧、糖剝奪[9，10]等病理因素均可導(dǎo)致ERS。其中缺氧是激發(fā)ERS的主要因素[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是機(jī)體內(nèi)蛋白折疊的重要場(chǎng)所，缺氧可直接導(dǎo)致二硫鍵形成受阻和ATP生成不足，影響肽鏈折疊，未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，從而促發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)，激活ERS。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，ERS有抑制物阻抗性酯酶1(inositol requirement 1,IRE-1)、活化轉(zhuǎn)錄因子-6(activating transcription factor-6,ATF-6)和雙鏈RNA激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)介導(dǎo)的3條通路。當(dāng)存在缺氧等應(yīng)激時(shí)，活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白(PERK、IRE1和ATF6)胞漿部分進(jìn)入核內(nèi)，與ERS反應(yīng)元件(ERS response element,ERSE)保守基序CCAAT(N9)GCACG中的GCACG結(jié)合，啟動(dòng)CHOP轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[3]。CHOP屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，也叫DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3(DNA damage-inducible transcript 3,DDIT3)，或生長(zhǎng)抑制DNA損傷基因153(growth arrest and DNA damage- inducible gene 153,GADD153)，分子量為29 kD，人CHOP由169 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含有一個(gè)N端轉(zhuǎn)錄激活域和C端的堿性鋅指(bZIP)結(jié)構(gòu)域。CHOP是ERS特異轉(zhuǎn)錄因子；靜息狀態(tài)下，即不存在ERS時(shí)，在多種類型的細(xì)胞胞漿中低水平表達(dá)；當(dāng)ERS通路被激活，其表達(dá)顯著增加。在結(jié)直腸腺瘤癌變-腸癌形成過(guò)程中，由于癌細(xì)胞失控性生長(zhǎng)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，而新生血管網(wǎng)又不能及時(shí)建立，氧供應(yīng)遠(yuǎn)少于氧需求，癌細(xì)胞常處于缺氧微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)缺氧在CRC惡性進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[12]。本研究通過(guò)對(duì)結(jié)直腸腺瘤及癌變組織CHOP蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤和腺癌CHOP陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常腸黏膜和早期腺瘤，提示在結(jié)直腸腺瘤癌變過(guò)程ERS被激活。其他學(xué)者通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)實(shí)體腫瘤缺氧可激活PERK-eIF2α、IRE1-XBP1和ATF6通路，如Shuda等[13]研究發(fā)現(xiàn)人肝癌組織中ATF6、IRE1-XBP1通路被激活，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，腫瘤向惡性方向發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)CHOP表達(dá)與腺瘤的大小、病理類型以及腸癌的大小、浸潤(rùn)深度相關(guān)。隨著腺瘤癌變-腸癌發(fā)生-腫瘤進(jìn)展，CHOP表達(dá)逐漸增加，提示CHOP與腺瘤和腸癌的惡性程度有關(guān)，與Zheng等[14]和Zhang等[15]報(bào)道的胃癌高侵襲性和預(yù)后差與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78高表達(dá)有關(guān)結(jié)果一致?？赡軝C(jī)制是由于腫瘤逐漸增大，惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖速度加快，導(dǎo)致血管供應(yīng)不足和缺氧加重，從而激發(fā)更嚴(yán)重的ERS。

細(xì)胞凋亡與增殖在正常生理狀態(tài)下維持動(dòng)態(tài)平衡，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙都可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]。多數(shù)研究認(rèn)為結(jié)直腸上皮惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中存在“細(xì)胞選擇性增殖”現(xiàn)象，腺瘤癌變過(guò)程細(xì)胞凋亡逐漸減少而細(xì)胞增殖逐漸增多，細(xì)胞過(guò)度增殖和凋亡受抑共同參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17]。另有學(xué)者則觀點(diǎn)相反，認(rèn)為腫瘤組織存在細(xì)胞過(guò)度增殖的同時(shí)，亦伴隨著腫瘤細(xì)胞的凋亡活躍，并提出可能機(jī)制是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，機(jī)體通過(guò)增加細(xì)胞凋亡以淘汰具有突變傾向的細(xì)胞，以盡力防止惡變[18]。本研究通過(guò)對(duì)結(jié)直腸腺瘤癌變不同階段組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤和腺癌AI顯著高于正常腸黏膜和早期腺瘤，提示CRC癌前病變階段(包括高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤)細(xì)胞凋亡已非?；钴S；研究還發(fā)現(xiàn)AI與結(jié)直腸腺瘤的大小、病理類型和腸癌的大小明顯相關(guān)。腫瘤越大、惡性度越高，細(xì)胞凋亡越頻繁。可能機(jī)制是在腺瘤癌變-細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，惡性細(xì)胞過(guò)度增殖使得局部血供和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)相對(duì)不足導(dǎo)致缺氧，從而激活ERS，通過(guò)轉(zhuǎn)錄上調(diào)CHOP蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加以維持機(jī)體平衡[19]，腫瘤才得以在缺氧應(yīng)激下繼續(xù)生存并發(fā)展。然而，這種推測(cè)有待于進(jìn)一步考證。

細(xì)胞凋亡是多基因多環(huán)節(jié)調(diào)控的一個(gè)嚴(yán)密完整的、主動(dòng)有序的死亡過(guò)程[20]。ERS是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控通路。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ERS可抑制細(xì)胞凋亡[21]，參與腫瘤耐藥機(jī)制；但更多的研究則表明ERS通過(guò)轉(zhuǎn)錄上調(diào)CHOP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，如Woo[22]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能通過(guò)上調(diào)CHOP誘導(dǎo)人類結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡；硒通過(guò)誘導(dǎo)CHOP抑制甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和惡變的腺瘤和腺癌組織CHOP陽(yáng)性表達(dá)者AI顯著高于陰性表達(dá)者，在具有某相同臨床病理特征的腺瘤和腸癌組織中CHOP陽(yáng)性表達(dá)者AI明顯高于CHOP陰性表達(dá)者，提示CHOP表達(dá)與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，CHOP可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)腺瘤癌變。CHOP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制未明，有研究認(rèn)為可能是通過(guò)增加其靶蛋白TRB3表達(dá)，減少Akt磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]；CHOP有死亡受體DR5結(jié)合位點(diǎn)，因此也可通過(guò)上調(diào)DR5激活死亡受體途徑[25]誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果提示CHOP和細(xì)胞凋亡異常共同參與結(jié)直腸腺瘤癌變-腸癌發(fā)生過(guò)程，CHOP表達(dá)與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，CHOP可能通過(guò)促細(xì)胞凋亡介導(dǎo)結(jié)直腸腺瘤癌變。該結(jié)論初步揭示了腺瘤癌變過(guò)程ERS通路可能被激活并通過(guò)干預(yù)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)腺瘤癌變，為下一步研究ERS對(duì)腺瘤癌變的確切作用及信號(hào)通路提供依據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有望為CRC的預(yù)測(cè)和早診新方法的確立提供新思路。

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RelationshipbetweenCHOPexpressionandapoptosisincolorectaladenomasandcanceroustissues

CHEN Jun-rong1,LI Chu-jun1,YANG Hui-ling2,ZHANG Jun-xiao1,WANG Su-mei2,ZHU Ying-yu1,YE Xiao-dan1

(1TheSixthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;2DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:lichujun@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To study the expression of C/EBP homologous protein (CHOP) and cell apoptosis in colorectal adenomas and cancerous tissues,and investigate their relationship with clinicopathological characteristics.METHODSImmunohistochemistry[with Streptococcus avidin-biotin complex (SABC) method]and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) were used to detect CHOP expression and cell apoptosis,respectively,in 59 cases of normal colonic mucosae,67 cases of colorectal adenomas and 56 cases of colorectal adenocarcinomas.RESULTSThe CHOP-positive rates in adenomas with high-grade intraepithelial neoplasia,adenomas with malignant transformation and colorectal adenocarcinomas were significantly higher than those in normal colonic mucosas and colorectal adenomas in the early stage (Plt;0.05).The expression of CHOP was related with the adenoma size and pathological type,as well as the size and infiltration depth in colorectal cancer.The apoptotic index (AI) in adenomas with high-grade intraepithelial neoplasia,adenomas with malignant transformation and colorectal adenocarcinomas was significantly higher than that in normal colonic mucosas and colorectal adenomas in the early stage (Plt;0.05).The AI was related with the adenomas size,stage and pathological type,as well as the size of colorectal cancer.The AI of tumors with CHOP overexpression was significantly higher than that of the tumors with negative CHOP in adenomas with high-grade intraepithelial neoplasia,adenomas with malignant transformation and colorectal adenocarcinomas (Plt;0.05).The AI of tumors with CHOP overexpression was significantly higher than that of the tumors with negative CHOP in colorectal adenomas or adenocarcinomas with the same clinicopathological characteristics (Plt;0.05).CONCLUSIONThe abnormality of CHOP expression and cell apoptosis might participate in the carcinogenesis of colorectal adenomas.The expression of CHOP is related with AI.CHOP may mediate the carcinogenesis of colorectal adenomas through promoting cell apoptosis.

Colorectal neoplasms; C/EBP homologous protein; Apoptosis

1000-4718(2011)05-0875-08

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.009

2011-01-21

2011-04-07

廣東省科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(No.2005B30501004)

△通訊作者 Tel：020-38254116；E-mail：lichujun@mail.sysu.edu.cn