顧卉，佟宇鑫，劉彤，李慧，李丹妮，袁正偉

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物教研室，細(xì)胞生物學(xué)教育部、衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.第9 4期臨床醫(yī)學(xué)系，沈陽 1 1 0 0 0 1）

LMO家族是只包含LIM結(jié)構(gòu)域的一類蛋白，由兩個(gè)串聯(lián)的LIM結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。LIM結(jié)構(gòu)域，大約有55個(gè)氨基酸，是一種高度保守的半胱氨酸富集的鋅指結(jié)構(gòu)基序。LMO家族包括4個(gè)成員（LMO1~4），其中LMO1是重要的一員，其編碼序列全長為470個(gè)堿基，編碼157個(gè)氨基酸。LMO1在核內(nèi)與其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與細(xì)胞譜系的決定、細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的控制。研究表明，LMO1與急性T淋巴細(xì)胞白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1~3］。

LMO1中的LIM結(jié)構(gòu)域可作為蛋白質(zhì)相互作用的表面，與其他蛋白如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合形成復(fù)合體，來間接影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，因而成為細(xì)胞核內(nèi)的輔助轉(zhuǎn)錄因子［4］。本研究旨在構(gòu)建LMO1基因全長及其截短突變體的原核表達(dá)載體，并在原核細(xì)胞大腸埃希菌E.coli中表達(dá)其融合蛋白，為LMO1的結(jié)構(gòu)功能及其信號通路的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pGEX-5X-2購自美國Clontech公司；E.coliDH5α和BL21均由實(shí)驗(yàn)室自行制備；PyrobestTMDNA聚合酶、BamHⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、電泳凝膠回收試劑盒均購于NEB公司；DNA marker、Protein marker 購于南京金斯瑞公司；異丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）購于Amresco公司；抗GST單克隆抗體購于Cell Signaling公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠第二抗體購于中山公司；ECL試劑盒購于GE公司。引物合成與DNA序列測定由南京金斯瑞公司完成。

表1 構(gòu)建L MO 1全長及截短突變體原核表達(dá)質(zhì)粒所用引物序列T a b.1 T h e p r i me r s o f t h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s mi dL MO 1a n d i t s d e l e t i o n mu t a n t s

1.2 全長及截短突變體原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pcDNA-3.1/His A-LMO1為模板，PCR擴(kuò)增LMO1基因全長及其截短片段（圖1），所用PCR擴(kuò)增引物見表1。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)行如下循環(huán)：95℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，循環(huán)30次，72℃再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收PCR產(chǎn)物后，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，再次電泳純化回收后，與同樣經(jīng)過BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-5X-2連接，4℃過夜后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單克隆菌落，接種并培養(yǎng)過夜。用堿裂解法提取質(zhì)粒后，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確，經(jīng)進(jìn)一步測序證實(shí)序列正確無突變后，將LMO1基因全長質(zhì)粒命名為FL，各截短突變體質(zhì)粒分別命名為A~E。

1.3 重組蛋白在原核細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)

將全長及截短突變體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21中，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落，接種并37℃培養(yǎng)過夜，1∶200稀釋菌液后繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6左右時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，30℃誘導(dǎo)3 h后，收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將PAGE膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，再經(jīng)脫色后觀察結(jié)果。

1.4 Western blot分析

將誘導(dǎo)成功的融合蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，4℃轉(zhuǎn)膜過夜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗膜 3次，10 min，加入抗 GST 抗體（1∶1 000），室溫慢慢搖晃雜交2 h，TBST洗膜3次，10 min，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫慢慢搖晃雜交1 h，TBST洗膜3次，10 min，ECL發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 LMO1全長及截短突變體原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將構(gòu)建的LMO1原核表達(dá)質(zhì)粒FL，A~E經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切并瓊脂糖凝膠電泳后分別得到約 5 kb 及 480，249，189，222，180，372 bp 的兩條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。經(jīng)進(jìn)一步DNA測序鑒定序列正確，無突變。

圖1L MO 1及其截短突變體模式圖F i g.1 S c h e ma t i c d i a g r a ms o fL MO 1a n d t h e i r d e l e t i o n mu t a n t s

圖2 重組質(zhì)粒F L，A~E經(jīng)B a mHⅠ/E c o RⅠ雙酶切鑒定電泳結(jié)果F i g.2 B a mHⅠ/E c o RⅠd i g e s t i o na n de l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i so f t h e p l a s mi d s F L，A~E

2.2 LMO1重組質(zhì)粒在原核細(xì)胞E.coli中的誘導(dǎo)表達(dá)

將LMO1重組質(zhì)粒FL，A~E分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，挑取單克隆，在 1 mmol/L IPTG，30℃，3 h的條件下誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，考馬斯亮藍(lán)染色后分別在 43，35，32，34，32 和39 kDa附近出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其分子量分別與預(yù)期的重組融合蛋白FL，A~E相符（圖3）。

2.3 GST-LMO1重組融合蛋白的Western blot鑒定

Western blot法鑒定LMO1全長及截短突變體融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果可見在分子量分別約為43，35，32，34，32 和 39 kDa附近出現(xiàn)特異性條帶（圖4），為LMO1全長及截短片段分子量（分別為17，9，6，8，6和 13 kDa）與原核載體 pGEX-5X-2 中 GST 分子量（26 kDa）之和，說明LMO1的全長與截短突變體重組融合蛋白正確表達(dá)。

3 討論

圖3 S D S-P A G E分析G S T-L MO 1融合蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)F i g.3 S D S-P A G Ea n a l y s i so f t h ee x p r e s s i o no f G S T-L MO 1f us i o n p r o t e i n s i n p r o k a r y o t i c c e l l

圖4 We s t e r nb l o t法分析G S T-L MO 1全長及其截短突變體融合蛋白的表達(dá)F i g.4We s t e r nb l o t a n a l y s i so f G S T-L MO 1f u l l l e n g t ha n di t s d e l e t i o n mu t a n t f u s i o n p r o t e i n s

LMO是僅含LIM結(jié)構(gòu)域的單純LIM蛋白家族中的一類，它含有一個(gè)或多個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域是一種高度保守的半胱氨酸富集的鋅指結(jié)構(gòu)基序，是胚胎發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)蛋白，在決定細(xì)胞命運(yùn)、控制細(xì)胞生長及分化中起著關(guān)鍵的作用［5］。研究證實(shí)，LMO1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系：過表達(dá)LMO1的轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)育不成熟，形成急性T淋巴細(xì)胞白血病，提示它是T淋巴細(xì)胞白血病的原癌基因［6］；有報(bào)道表明LMO1與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］；并且參與胃癌中的凋亡過程［3］。

為了研究LMO1的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能，獲得LMO1純化蛋白，根據(jù)LMO1全長及截短序列，設(shè)計(jì)了6對特異性的引物，并在引物中引入了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，以質(zhì)粒pcDNA-3.1/His ALMO1為模板，擴(kuò)增出LMO1基因全長及其截短突變體序列，利用酶切電泳鑒定以及DNA測序的方法，證實(shí)了pGEX-5X-2-LMO1全長及其截短突變體重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。并在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了其重不好；膽堿酯酶復(fù)能劑吸收差，且只能在72 h內(nèi)應(yīng)用，對已經(jīng)老化的膽堿酯酶無效。因此，尋找一種新的更為有效的減少有機(jī)磷中毒的死亡率和致殘率的藥物是該領(lǐng)域研究中急待解決的關(guān)鍵問題。上世紀(jì)80年代，人們提出有機(jī)磷生物清除劑的概念，即在有毒的有機(jī)磷到達(dá)靶器官前能夠鰲合或中和它們的酶或拮抗劑，并且用很小的量就可以達(dá)到有機(jī)磷清除的目的。提出清除劑的理論后，人們把目光聚焦在對PON1—哺乳動物血漿內(nèi)的一種在有機(jī)磷中毒的自然防御中發(fā)揮作用的天然催化清除劑，并稱之為最有前景的有機(jī)磷生物清除劑［1，8，9］。

本研究中，DDVP毒代動力學(xué)的結(jié)果支持PON1可以水解DDVP，降低DDVP的血中濃度。但應(yīng)用阿托品+PAM-CL后，血中DDVP濃度并沒有降低。這說明阿托品+PAM-CL對DDVP沒有水解作用，與之前的研究相一致。同時(shí)，PON1與阿托品+PAM-CL聯(lián)合應(yīng)用也沒有比單獨(dú)應(yīng)用PON1水解療效強(qiáng)，因此，PON1聯(lián)合應(yīng)用阿托品+PAM-CL對PON1的催化水解作用沒有藥物間相互作用，所以兩種方法可以在臨床上聯(lián)合應(yīng)用。

AUC、MRT和Cmax是評價(jià)毒代動力學(xué)的重要指標(biāo)，AUC值用來評價(jià)藥物的入血量，MRT用來評價(jià)藥物在體內(nèi)的保留時(shí)間，Cmax用來評價(jià)藥物在體內(nèi)的最高濃度。本研究結(jié)果顯示，與染毒組大鼠相比，應(yīng)用PON1后，AUC值明顯降低，Cmax明顯減小，體內(nèi)DDVP的入血量明顯降低，峰濃度降低。但對平均保留時(shí)間影響不大。

綜上所述，純化兔血清PON1可以明顯改善大鼠體內(nèi)膽堿酯酶抑制水平，并可以明顯降低DDVP入血量，降低峰濃度。

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