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基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白在百草枯致肺纖維化大鼠肺組織中表達(dá)及其意義

2011-08-21 13:46:32杜妍肖莉
關(guān)鍵詞:百草肺纖維化肺泡

杜妍,肖莉

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科,沈陽 110004)

百草枯(paraquat,PQ)為有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑,對人有較強(qiáng)毒性,目前中毒機(jī)制尚不明確,無特效治療方案?;|(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)是一類主要降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的蛋白酶,在生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)MMP3、MMP8與肺纖維化有著密切的聯(lián)系[1]。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射百草枯可致大鼠肺纖維化,此病理過程與人類百草枯致肺纖維化過程極其相似,因此,本實(shí)驗(yàn)研究百草枯對肺組織病理改變的影響,進(jìn)一步研究MMP3、MMP8在百草枯致急性肺損傷及纖維化肺組織中的表達(dá)及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。百草枯(99.99%,貨號:856177-1G)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。MMP3(貨號:bs-0413R)、MMP8(貨號:bs-1913R)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物模型的建立、分組及標(biāo)本處理

雄性 SD 大鼠40只,SPF 級,體質(zhì)量(295±20)g,隨機(jī)分為模型組(PQ組)和鹽水對照組(NS組),每組20只。NS組一次性腹腔注射生理鹽水8.5 mL/kg。PQ組一次性腹腔注射百草枯15.0 mg/kg。分別于給藥后5 d、28 d處死動物,HE染色觀察肺纖維化程度,免疫組化法觀察各組動物MMP3、MMP8蛋白表達(dá)。

1.3 肺泡炎癥、肺纖維化程度判斷

肺組織石蠟切片HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。按照Szapiel等[3]的方法評價(jià)肺組織病理變化嚴(yán)重程度,評分標(biāo)準(zhǔn)如下:無肺泡炎或無纖維化且肺組織受累面積為0記為“-”;輕度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積<20%記為“+”;中度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積20%~50%記為“++”;重度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積>50%記為“+++”。

1.4 免疫組化法檢測肺組織MMP3、MMP8蛋白表達(dá)

肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,然后按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)軟件,肺組織HE染色肺泡炎或纖維化程度資料用秩和檢驗(yàn)Ridit方法,Ridit法是將按等級分組的資料,通過轉(zhuǎn)換成為一組連續(xù)性的計(jì)量資料,計(jì)算Ridit值(簡稱R值),屬于一種非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法。肺組織免疫組化法觀察MMP3、MMP8蛋白表達(dá)資料以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織的病理學(xué)改變

對照組大鼠肺臟外觀大致正常,鏡下未見炎性細(xì)胞浸潤和膠原沉積。模型組大鼠5 d時肺組織外觀明顯腫脹,鏡下示肺泡間隔明顯增寬變形,肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)重度炎性細(xì)胞浸潤,以單核/巨噬細(xì)胞為主,大部分形成炎癥灶,成纖維細(xì)胞增多,病灶內(nèi)已出現(xiàn)肺泡萎縮。28 d時外觀呈蒼白色,腫脹已基本消退,體積縮小,彈性更差,硬度增加,表面呈結(jié)節(jié)樣改變并可見條索狀凹溝,鏡下可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞,成纖維細(xì)胞大量增生,纖維組織呈條索樣瘢痕改變,斑片狀分布,但外周肺實(shí)質(zhì)炎癥有更進(jìn)一步的吸收(表 1,圖 1)。

表1 各組大鼠肺組織H E染色肺泡炎或纖維化程度(n)Tab.1 HE staining of lung tissue of rats alveo litis orfibrosis(n)

圖1 各組大鼠肺組織H E染色的動態(tài)變化 ×200Fig.1 The HE staining of lung tissue dynam ics×200

2.2 免疫組化法檢測MMP3、MMP8在大鼠肺組織內(nèi)的分布

MMP3、MMP8在正常組大鼠肺組織內(nèi)呈弱表達(dá)。模型組大鼠5 d時肺組織中MMP3、MMP8的表達(dá)增強(qiáng),到28 d時已基本達(dá)到正常水平(表2,圖2、3)。

表2 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP3、MMP8蛋白表達(dá)(O D值)Tab.2 Rats ineach group immunohist ochemistry inlung tissue was observed mmP3,M M P8prot ei n expressi on(O D val ue)

圖2 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP3蛋白表達(dá)動態(tài)變化(200×)Fig.2 Lung tissue of rats ineach group were observed by immunoh is tochem istry MM P3 prote in dynam ics(200×)

圖3 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP8蛋白表達(dá)動態(tài)變化 ×200Fig.3 Lung tissue of rats in each group were observed by im munoh istochem istry MM P8 protein dynam ics×200

3 討論

百草枯化學(xué)名為 1,1′-二甲基 4,4′-聯(lián)吡啶陽離子鹽,為有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑[3]。百草枯對人有較強(qiáng)毒性,由于其中毒致死量小、無特效解毒劑、常規(guī)對癥治療效果極差,故死亡率較高,國外報(bào)道百草枯中毒病死率40%~50%[4]。重度中毒患者可在短時間內(nèi)死于多臟器功能衰竭,中度中毒時主要損害肺臟,對人有較強(qiáng)毒性,在對人體的損害中主要表現(xiàn)為肺組織的損傷,PQ經(jīng)胃腸道吸收入血后通過多胺攝取途徑可特異性聚集于肺臟,濃度比血液高6~10倍[5],患者于染毒后24 h迅速出現(xiàn)肺水腫、肺出血及肺不張等急性肺損傷癥狀,并進(jìn)行性發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征,患者如能度過1周左右的急性期,肺部損傷逐漸加重,發(fā)展為不可逆的肺間質(zhì)纖維化,后期多死于呼吸衰竭[6]。肺纖維化的病理特征是肺泡上皮的損傷和成纖維細(xì)胞增殖,目前發(fā)病機(jī)制尚不清,目前對百草枯中毒機(jī)制的研究主要集中在以下幾方面:氧自由基損傷、炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子及趨化因子、基因異常表達(dá)等方面。

MMPs是一類主要降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的蛋白酶,在生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。MMPs是一類高度保守的鋅離子依賴內(nèi)肽酶家族,至少有26種人類MMPs[7]。MMPs可以分為3個結(jié)構(gòu)區(qū)域:N端的前肽區(qū),催化區(qū)和C端的類血結(jié)區(qū)。MMPs以無活性形式合成,被激活后才有活性。MMPs主要通過兩種途徑被激活,其一是N端的前肽區(qū)變構(gòu)或轉(zhuǎn)位,其二是N端的前肽區(qū)被酶切。它們被激活后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,同時也可以降解非細(xì)胞外基質(zhì)成分蛋白,如生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑和其他蛋白酶,從而調(diào)節(jié)這些化合物的生物活性?;|(zhì)金屬蛋白酶的這一作用可以預(yù)防或引發(fā)疾病,如癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病和各種結(jié)締組織?。?]。多位學(xué)者在PQ致肺纖維化機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)某些基因表達(dá)異常,目前研究最多的是MMP2和MMP9,認(rèn)為它們是降解肺泡基膜主要成分IV型膠原的主要酶類,對肺組織的重構(gòu)有不可忽視的作用。與此同時對MMP3、MMP8的研究相對較少。Tomita等[4]對C57Black/6J大鼠鼻內(nèi)飼入不同劑量PQ,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在染毒后的5 d內(nèi),肺纖維化尚未形成,但已經(jīng)有基因表達(dá)的改變,其中包括MMP3和MMP8,因此本實(shí)驗(yàn)研究 MMP3、MMP8,探討 MMP3、MMP8與肺纖維化之間的關(guān)系。結(jié)果提示,肺纖維化的發(fā)生與MMP3、MMP8的異常表達(dá)直接相關(guān),提示它們可能是PQ致肺纖維化的標(biāo)志物。

綜上所述,MMP3、MMP8蛋白在百草枯誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織中的表達(dá)增強(qiáng),后進(jìn)行性下降至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(染毒后28 d)時基本接近正常,提示MMP3、MMP8可能是PQ致肺纖維化的標(biāo)志物,對MMP3、MMP8的檢驗(yàn)將具有重要的臨床意義并進(jìn)一步指導(dǎo)治療。但本實(shí)驗(yàn)并未深入的研究MMP3、MMP8參與肺纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制,這將是我們下一步實(shí)驗(yàn)工作的重點(diǎn)。

[1]Tomita M,Okuyama T,Katsuyama H,et al.Mouse model of paraquatpoisoned lungs and its gene expression profile[J].Toxicology,2007,231(2-3):200-209.

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