劉素梅，韓 立，方忠意，李華岑，王 麗，張躍京，臧合英

(1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008;2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450001)

隨著食品安全逐漸成為全球性的熱點(diǎn)話題，畜產(chǎn)品中獸藥殘留問題對(duì)動(dòng)物性食品安全的影響逐漸凸顯出來。中藥在畜牧生產(chǎn)中作為藥物或飼料添加劑用于防治動(dòng)物疾病、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、改善產(chǎn)品品質(zhì)越來越受到重視。但有些不法企業(yè)為了增強(qiáng)中藥的療效，常在中獸藥中非法添加化學(xué)藥物，造成畜禽機(jī)體中毒，產(chǎn)品中獸藥殘留超標(biāo)等問題，嚴(yán)重危害人們的健康。

磺胺類藥物為化學(xué)合成抗菌藥，其中有些成分具有抗原蟲作用，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶等，雞球蟲散和驅(qū)蟲散為《中國獸藥典》中收載的抗原蟲的藥物，本試驗(yàn)對(duì)這兩種散劑中添加上述磺胺類藥物進(jìn)行了高效液相色譜法的研究［1］，利用二極管陣列檢測器進(jìn)行樣品的全波長掃面，根據(jù)樣品的色譜保留時(shí)間、吸收光譜進(jìn)行定性檢查，以色譜峰面積進(jìn)行定量計(jì)算，可以快速準(zhǔn)確地檢查出中藥中是否添加磺胺類藥物及其含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備 Waters UPLC超高效液相色譜，二極管陣列檢測器，Empower2色譜工作站;MILIPORE超純水器;METTLER XP205電子天平。

1.2 試藥及試劑 磺胺嘧啶對(duì)照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為H0361103，含量為100.0%;磺胺二甲嘧啶鈉對(duì)照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為 H0371008，含量為99.8%;磺胺間甲氧嘧啶鈉對(duì)照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為C0031007，含量為99.4%;磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為H040105，含量為100%;磺胺氯吡嗪鈉對(duì)照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為H0281207，含量為100.0%;磺胺喹噁啉對(duì)照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為H121104，含量為99.0%;雞球蟲散由鄭州神普科技有限公司提供;驅(qū)蟲散由河南旭隆獸藥有限公司提供;甲醇和乙腈為色譜純?cè)噭?，水為超純水，其他試劑為分析純?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm，2.1×100 mm)色譜柱;檢測波長范圍:190～400 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為3 μL;流動(dòng)相 A相:0.017 mol/L的磷酸溶液，B相:乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 精密稱取六種磺胺類藥物各100 mg分別置50 mL量瓶中，加甲醇配成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，臨用前用流動(dòng)相稀釋成濃度為 0.2、0.5、1、5、20、50、100、200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，過0.2 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 樣品制備

2.3.1 參照《獸藥使用指南》里磺胺類藥物的用量及向有關(guān)獸藥企業(yè)技術(shù)人員了解，磺胺類的添加量在0.8% ～1%左右，所以本實(shí)驗(yàn)按照磺胺類藥物含量為1%的量進(jìn)行添加。取雞球蟲散和驅(qū)蟲散各10 g，精密稱定，分別精密加6種磺胺類藥物各0.1 g，充分混勻，制成陽性樣品(即磺胺類藥物含量為1%)。

2.3.2 取雞球蟲散和驅(qū)蟲散作為陰性樣品。

2.4 供試品溶液的制備 取樣品1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超聲提取30 min，靜置，精密量取上清液5 mL置50 mL量瓶中，加初始比例的流動(dòng)相稀釋至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.5 線性關(guān)系的考察 取磺胺類系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高依次進(jìn)高效液相色譜儀，記錄277 nm處色譜圖，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2，色譜圖見圖1-圖5。

表2 回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.6 準(zhǔn)確度和精密度考察 精密稱取2.3.1項(xiàng)下的陽性樣品1 g，按照2.4項(xiàng)下供試品溶液的制備進(jìn)行操作，進(jìn)高效液相色譜儀分析，測定6種磺胺類組份的峰面積，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見表3。

圖5 雞球蟲散陽性樣品色譜圖

表3 回收率測定結(jié)果

2.7 檢測限的確定 分別取一個(gè)雞球蟲散和驅(qū)蟲散陽性樣品譜圖，計(jì)算每個(gè)組分的信噪比(S/N)，按S/N≥3為檢測限，確定雞球蟲散和驅(qū)蟲散中，檢測限為0.02%。

2.8 定量限 按照信噪比(S/N)=10為定量限，確定定量限為0.05%。取驅(qū)蟲散和雞球蟲散陰性對(duì)照1 g，加入陽性添加樣品(1%)0.05 g，各5份，按照供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，進(jìn)高效液相色譜儀分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 定量限回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 專屬性 取驅(qū)蟲散、雞球蟲散陰性樣品各1 g，按照供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，進(jìn)高效液相色譜儀分析，色譜圖見圖2、圖4。由圖可知，在該色譜條件下6種峰無干擾。

2.10 樣品檢測結(jié)果判定 供試品色譜圖中如出現(xiàn)與相應(yīng)對(duì)照品峰保留時(shí)間一致的色譜峰，查看該峰的光譜圖，若與對(duì)照品光譜圖無明顯差異，最大吸收波長一致，則表示檢出該組分。然后采用277 nm處峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.11 HPLC色譜條件 由于條件局限，本實(shí)驗(yàn)采用的是超高效液相色譜-二極管陣列檢測器進(jìn)行試驗(yàn)研究。考慮到UPLC應(yīng)用不如HPLC普遍，以270 nm為吸收波長，將色譜條件由UPLC的方法向HPLC進(jìn)行了轉(zhuǎn)換，具體色譜條件為:Waters 2695高效液相色譜儀，2489紫外檢測器，Empower2色譜工作站;XBridge C18(5 μm，4.6 ×150 mm)色譜柱，梯度洗脫程序見表5，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。

表5 HPLC梯度洗脫程序

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)過程中先后嘗試了甲醇-乙腈-水-冰乙酸系統(tǒng)［2］、乙腈-三乙胺溶液系統(tǒng)和乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)［3］，最終確定柱效高、分離度好的乙腈-0.017 mol/L磷酸溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

3.2 中藥中基質(zhì)復(fù)雜，干擾成分比較多，采用二極管陣列檢測器，通過光譜鑒別可以排除干擾，準(zhǔn)確地檢測中藥中是否添加磺胺類藥物。

3.3 經(jīng)過對(duì)6種磺胺類藥物的反復(fù)試驗(yàn)，甲醇對(duì)這6種藥物有很好的溶解性，因此，樣品提取溶劑用甲醇。樣品經(jīng)過超聲提取，提取效率高，同時(shí)考察了超聲30 min和超聲60 min的提取效果，結(jié)果兩者沒有顯著差異，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了超聲提取30 min的方法進(jìn)行供試品溶液的制備。另外根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，本實(shí)驗(yàn)選取了曲線中間點(diǎn)作為樣品上機(jī)濃度。

［1］中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二○○五年版二部［S］.

［2］高迎春，蘇 梅，魏秀麗，等.薄層色譜和液相色譜法鑒別中獸藥散劑中摻加的磺胺喹噁啉鈉［J］.中國獸藥雜志，2010，44(2):23-25.

［3］動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測方法-高效液相色譜法［S］.