楊麗萍，高淑霞，張秀玲，孫海濤，姜文學(xué)

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

地克珠利(Diclazuril)是20世紀(jì)80年代由比利時(shí)楊森制藥公司開發(fā)研制的非聚醚類化學(xué)合成抗球蟲藥，屬三嗪類化合物，具有高效、低毒、廣譜的特點(diǎn)，能有效地降低養(yǎng)禽業(yè)因球蟲感染帶來的經(jīng)濟(jì)損失［1］，在養(yǎng)兔業(yè)中也廣泛用于球蟲病的防治。

食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)和歐盟藥品管理局(European Medicines Agency)分別對(duì)地克珠利的毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行了評(píng)估，并推薦了日允許攝入量(Acceptable Daily Intakes)和最高殘留限量(MRLs)，農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告也對(duì)地克珠利的 MRLs作出規(guī)定［2-7］。已有研究多以 HPLC法［1］、毛細(xì)管電泳法［8］或 LC-MS/MS［9］法測(cè)定了家禽組織中地克珠利的殘留，但目前尚缺乏家兔血漿或組織中地克珠利檢測(cè)方法相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

對(duì)家兔血漿中地克珠利的HPLC檢測(cè)技術(shù)的研究試驗(yàn)，建立了快速、穩(wěn)定的家兔血漿中地克珠利的提取方法，為進(jìn)一步研究地克珠利在家兔組織中的殘留及其規(guī)律提供了技術(shù)支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 液相系統(tǒng):島津高效液相色譜儀，SPD-10A檢測(cè)器，CTO-10A柱溫箱，LC-10AD泵，DGU-4A脫氣裝置，N-2000雙通道色譜工作站;XH-C旋渦混合器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠);TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);BP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯股份有限公司);LD5-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);L-128氮吹濃縮儀(北京來亨科貿(mào)有限公司技術(shù)開發(fā)中心)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純，三乙胺、乙酸、乙酸乙酯、N，N二甲基甲酰胺(DMF)為分析純。對(duì)照品地克珠利購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào):H0130805，含量為99.7%。妥曲珠利由湖北省武穴市龍翔藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):090103，含量為98.5%。

2 對(duì)照溶液的配制

精密稱取地克珠利10.03 mg，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解后，定容，搖勻，配成濃度為200 μg/mL的地克珠利對(duì)照溶液I。取對(duì)照溶液I用甲醇逐級(jí)稀釋為 180、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781 μg/mL 的對(duì)照溶液。精密稱取妥曲珠利10.11 mg，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容，搖勻，配成濃度為199 μg/mL的妥曲珠利對(duì)照溶液II。取對(duì)照溶液II用甲醇稀釋為99.5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)對(duì)照溶液。

3 色譜條件

色譜柱為依利特色譜柱(Hypersil ODS 2.5 μm，250 mm ×4.6mm);C18 保護(hù)柱規(guī)格為4.0 mm×10 mm(江蘇漢邦科技有限公司);流動(dòng)相為乙腈∶水∶三乙胺∶冰乙酸 =55 ∶45 ∶0.2 ∶0.12(V/V);流速為1.0 mL/min;柱溫為室溫;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm;進(jìn)樣量為 20 μL。

4 提取方法

取空白血漿0.18 mL，加入地克珠利對(duì)照溶液0.02 mL，加入 99.5 μg/mL 的妥曲珠利 0.02 mL，混勻后加入DMF 0.1 mL，渦旋提取30 s，加入乙腈0.2 mL，渦旋提取 30 s，樣品 12 000 r/min 離心 10 min，取上清液進(jìn)樣20 μL分析。

5 方法學(xué)考察

5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取空白血漿0.2 mL，除不加地克珠利及妥曲珠利外，按照4所述方法提取，所得空白色譜圖和配制樣品色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按地克珠利計(jì)算不低于3 000，地克珠利及妥曲珠利與相鄰色譜峰的分離度均大于2.0，拖尾因子分別為 1.01、1.05，出峰時(shí)間分別為 7.9 min 和11.1 min。

圖1 典型HPLC色譜圖

5.2 線性關(guān)系與檢測(cè)限 取空白血漿0.18 mL，加入 1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL地克珠利對(duì)照品溶液0.02 mL，使得血漿中地克珠利的濃度為 0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL，加入 99.5 μg/mL 的妥曲珠利0.02 mL，按照4所述方法提取，取上清液進(jìn)樣20 μL分析。以地克珠利與妥曲珠利峰面積的比值為縱坐標(biāo)、血漿中地克珠利的濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，地克珠利在0.156 ～20.0 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。回歸方程為Y=0.183 2x+0.001 0，r=0.999 2。在信噪比 S/N=3 的條件下，血漿中地克珠利的檢測(cè)限為0.078 μg/mL。

5.3 回收率與精密度試驗(yàn) 取空白血漿0.18 mL，加入0.02 mL不同濃度的對(duì)照溶液，配制成0.312、5.00、18.00 μg/mL 高、中、低 3 個(gè)濃度的對(duì)照血漿，按照4所述方法提取，平行操作5份，以血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得量與地克珠利加入量的比值計(jì)算方法回收率。分別于當(dāng)日和連續(xù)3天測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 地克珠利回收率與精密度測(cè)定(n=5)

6 討論

6.1 提取方法的選擇 比較了乙酸乙酯萃取、甲醇或乙腈沉淀蛋白、乙腈聯(lián)合DMF沉淀蛋白3種提取方法，采用乙酸乙酯液-液萃取法提取血漿中的地克珠利與沉淀蛋白沉淀法相比，雜質(zhì)較多，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)影響地克珠利與妥曲珠利的測(cè)定，且回收率低;采用甲醇或乙腈沉淀蛋白法對(duì)地克珠利與妥曲珠利的檢測(cè)無(wú)影響，但提取效率不及乙腈聯(lián)合DMF沉淀蛋白法的提取效率高。因地克珠利易溶于DMF中，先用DMF提取，為進(jìn)一步沉淀蛋白，再加入乙腈，使得離心后的樣品不必濾膜過濾，可以直接進(jìn)樣。

6.2 色譜柱的選擇 比較了不同廠家的色譜柱，考察了 Diamonsil C18(2.5 μm，250 mm ×4.6 mm)和 Hypersil ODS(2.5 μm，250 mm × 4.6 mm)色譜柱。結(jié)果地克珠利在各柱上的分析時(shí)間接近，但保留行為卻差異很大，Hypersil ODS色譜柱能夠?qū)悠穼?shí)現(xiàn)良好的分離。

6.3 流動(dòng)相的選擇 考察了乙腈∶水(50∶50)和甲醇∶水(70∶30)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈:水對(duì)樣品中組分能實(shí)現(xiàn)良好的分離，但地克珠利與妥曲珠利峰脫尾，故采用冰乙酸及三乙胺調(diào)整溶液pH值改善峰形。當(dāng)流動(dòng)相為乙腈∶水∶三乙胺∶冰乙酸=55∶45∶0.2 ∶0.12(V/V)時(shí)，地克珠利及妥曲珠利分離度很好，峰形也很好。

6.4 小結(jié) 試驗(yàn)建立了以妥曲珠利為內(nèi)標(biāo)，HPLC法測(cè)定家兔血漿中地克珠利含量，該方法具有簡(jiǎn)單快速、靈敏的特點(diǎn)，在一定濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回收率高，無(wú)干擾。

［1］施祖灝，朱良強(qiáng)，盧運(yùn)站，等.雞組織中地克珠利和妥曲珠利殘留 HPLC檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29(1):79-81.

［2］EMEA.Veterinary Medicines Evaluation Unit:Diclazuril(Extension to All Rum Inants and Porcine Species)，Summary Report(1，2)［R］.1996，2004.

［3］EMEA.Veterinary Medicines Evaluation Unit:Toltrazuril，Summary Report(1)［R］.1998，1999，2000，2004.

［4］JECFA.Toxicological Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food:Dielazuril，WHO Food Additives Series 36［R］.Geneva，1996.

［5］JECFA.Toxicological Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food Dielazuril，WHO Food Additives Series 41［R］.Geneva，1998.

［6］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào).動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［7］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典(二○○五年版)［S］.

［8］施祖灝，陸俊賢，葛慶聯(lián)，等.高效毛細(xì)管電泳法同時(shí)檢測(cè)地克珠利和妥曲珠利的含量［J］.中國(guó)獸藥雜志，2008，42(9):13-16.

［9］張 濤，張麗芳，江善祥，等.液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中地克珠利的殘留量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(14):6314-6316.