李丹妮，張文剛，嚴(yán) 鳳，顧 欣

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

可樂(lè)定(圖1)和賽庚啶(圖2)都屬合法的人醫(yī)用藥品?？蓸?lè)定(Clonidine)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腎上腺素能α2-受體激動(dòng)劑，對(duì)α2-受體具有特異親和性，屬于咪唑啉衍生物。作為抗高血壓藥物，其藥理作用主要為通過(guò)刺激腦干α2-腎上腺素受體導(dǎo)致交感神經(jīng)從中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳出減少，從而降低外周阻力、腎血管阻力、心率以及血壓，也有用于手術(shù)后的麻醉和鎮(zhèn)痛［1-2］。賽庚啶為人用抗過(guò)敏藥［3］，對(duì)抗體內(nèi)組胺對(duì)血管、支氣管平滑肌的作用，從而消除過(guò)敏癥狀，也可用于改善患者的食欲。

近年開(kāi)始出現(xiàn)將可樂(lè)定用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和改善酮體組成的研究［4-5］，推斷其主要的作用機(jī)理為通過(guò)促進(jìn)下丘腦生長(zhǎng)腺素神經(jīng)元合成和釋放生長(zhǎng)腺素，進(jìn)而調(diào)節(jié)腺垂體細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，從而調(diào)控生長(zhǎng)激素分泌，促進(jìn)生豬生長(zhǎng)。動(dòng)物研究表明在豬飼糧中添加0.5 mg/kg可樂(lè)定，能顯著提高豬的瘦肉率和眼肌面積，降低脂肪比率和背膘厚，改善豬的胴體組成。賽庚啶是H1受體拮抗劑，屬于抗組胺藥，但同時(shí)也是5-羥色胺受體拮抗劑，可在下丘腦食欲中樞拮抗5-羥色胺，這可以解釋賽庚啶具有刺激食欲的功能。目前在國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)將這兩種藥物違法添加在豬飼料中，2010年12月農(nóng)業(yè)部1519號(hào)公告已明確把可樂(lè)定和賽庚啶列入了《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》清單。

目前已有關(guān)于血樣和尿樣中可樂(lè)定及賽庚啶檢測(cè)方法的報(bào)道，主要采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS/MS)［6-8］。國(guó)內(nèi)已有采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)飼料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的方法［9-10］。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS/MS)技術(shù)，建立了飼料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的檢測(cè)方法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法通過(guò)采集離子碎片及豐度比，能夠更準(zhǔn)確進(jìn)行定性確證，同時(shí)大大提高了檢測(cè)的靈敏度，為準(zhǔn)確定性定量提供了更好的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀UPLC/Qμattro Premier XE(Waters公司);MassLynx v4.1質(zhì)譜工作站軟件;漩渦振蕩器;CL3R冷凍離心機(jī)(美國(guó)IEC公司);Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國(guó)Heidolph公司)。

1.2 藥品與試劑 鹽酸可樂(lè)定對(duì)照品，純度≥98%(Sigma公司);鹽酸賽庚啶對(duì)照品，純度≥98%(Sigma公司);乙腈色譜純(Merck公司);甲酸，純度96%(TEDIA);甲醇、鹽酸、氨水均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 液相色譜 色譜柱:SB C18100 mm ×3.0 mm，粒徑1.8 μm(美國(guó) Agilent公司)，柱溫 40 ℃;進(jìn)樣量5 μL;流速0.3 mL/min;流動(dòng)相為 A 相:乙腈;B相0.1%甲酸水溶液;梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜參考條件 電噴霧離子源，正離子電離(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓:3.0 Kv;離子源溫度:110℃;脫溶劑氣流量:700 L/h;錐孔氣:50 L/h;去溶劑溫度:350℃;碰撞氣(Ar)流量0.24 mL/min;碰撞室壓力:3.8 ×10-3Pa。分析中以保留時(shí)間和離子對(duì)(母離子和兩個(gè)子離子)的信息比較進(jìn)行定性分析;經(jīng)過(guò)優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 可樂(lè)定和賽庚啶的母離子、子離子及質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱(chēng)取鹽酸可樂(lè)定對(duì)照品，加入適量的水溶解，再用甲醇定容，配成含可樂(lè)定濃度約為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，2～8℃冷藏保存，有效期六個(gè)月。賽庚啶貯備液配制:精密稱(chēng)取鹽酸賽庚啶對(duì)照品，用甲醇配成含賽庚啶濃度約為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，2～8℃冷藏保存，有效期六個(gè)月。分別吸取鹽酸可樂(lè)定貯備液和鹽酸賽庚啶貯備液適量，置于棕色容量瓶中，用乙腈:0.2%甲酸水溶液(20/80，V/V)稀釋成可樂(lè)定和賽庚啶濃度均為 0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/L 的系列對(duì)照品工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 樣品的前處理 稱(chēng)取2.00 g試樣于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL鹽酸甲醇提取液(甲醇:0.1 mol/L HCl=80 ∶20)，充分振蕩 20 min，然后于7 000 r/min離心10 min，上清液備用。MCX(3CC/60 mg)固相萃取小柱先用3 mL甲醇，3 mL水活化。取上清液2 mL過(guò)柱，用2 mL水和2 mL甲醇淋洗，空氣抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(60℃)至干，用乙腈:0.2%甲酸水溶液(20/80，V/V)1 mL溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。若樣品液中含有的藥物濃度超出線性范圍，進(jìn)樣前可用一定體積的流動(dòng)相稀釋?zhuān)瓜♂尯笊蠙C(jī)液中的藥物濃度在線性范圍內(nèi)。

濃縮飼料及預(yù)合混料的濃度水平較高，可根據(jù)實(shí)際情況，在提取步驟中增加稀釋步驟后進(jìn)行凈化。

1.3.5 樣品回收率與精密度 選擇空白配合飼料、濃縮飼料及預(yù)混合飼料樣品做為基質(zhì)，在配合飼料中添加可樂(lè)定和賽庚啶濃度分別為0.02、0.04、0.1 mg/kg的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，前處理步驟按照1.3.4。在預(yù)混合飼料和濃縮飼料中添加可樂(lè)定和賽庚啶濃度分別為 0.2、0.5、1 mg/kg的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，預(yù)混合飼料及濃縮飼料在加入提取試劑后，準(zhǔn)確移取上清液1 mL到10 mL容量瓶中，加入鹽酸甲醇提取液(甲醇:0.1 mol/L HCl=80∶20)定容至刻度，取稀釋液2 mL過(guò)MCX小柱進(jìn)行凈化，其余步驟與配合飼料一致。每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.6 檢測(cè)限和定量限 取空白樣品，按1.3.4前處理步驟后，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)得噪音信號(hào)的平均值，按信噪比≥3為檢測(cè)限，信噪比≥10為定量限。

2 結(jié)果

2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定 圖3是可樂(lè)定和賽庚啶混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

圖3 可樂(lè)定和賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖(標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為10 ng/mL)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定工作液，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線 A賽庚啶=1 773.74+226.032C，線性相關(guān)系數(shù) r=0.999 2，A可樂(lè)定=207.371C+23.109 3，線性相關(guān)系數(shù) r=0.999 4。

2.3 精密度和回收率 選擇配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料空白樣品，按照本方法確定的條件進(jìn)行加標(biāo)回收重復(fù)性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤10%，表明采用本方法測(cè)定飼料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶具有較好的精密度、重復(fù)性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3-表5。

表3 配合飼料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶回收率和精密度

表4 預(yù)混合飼料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶回收率和精密度

表5 濃縮料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶回收率和精密度

由上表看出，按已確定的樣品提取條件和色譜條件測(cè)定添加回收量，實(shí)驗(yàn)表明配合飼料中可樂(lè)定和賽庚啶回收率達(dá)到70% ～100%，預(yù)混合飼料和濃縮飼料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶回收率達(dá)到70% ～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜10%，說(shuō)明該方法對(duì)不同種類(lèi)飼料樣品中，不同含量的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的測(cè)定均有較好的準(zhǔn)確度。圖4-圖9為空白飼料及添加回收率MRM色譜圖。

2.4 檢測(cè)限和定量限 飼料樣品中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶方法最低檢測(cè)限為0.01 mg/kg，信噪比S/N(Peak to Peak)＞3。方法最低定量限為0.02 mg/kg，信噪比 S/N(Peak to Peak)＞10。

圖9 濃縮飼料中可樂(lè)定和賽庚啶添加回收率MRM圖(添加濃度0.2 mg/kg)

3 討論

3.1 工作液稀釋溶劑的選擇 我們嘗試選擇中性溶劑甲醇、0.2%甲酸、0.2%甲酸∶乙腈 =50 ∶50、0.2%甲酸∶乙腈=20∶80等作為最終進(jìn)樣前的樣品溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)溶劑對(duì)樣品的影響較大，而且對(duì)賽庚啶和可樂(lè)定具有不同的效果，當(dāng)增加溶劑中有機(jī)溶劑比例時(shí)賽庚啶的溶解性增強(qiáng)，峰面積增大，靈敏度提高，同時(shí)可樂(lè)定的靈敏度降低。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣溶劑最接近流動(dòng)相梯度洗脫起始比例時(shí)，可使可樂(lè)定和賽庚啶的分離度和峰的對(duì)稱(chēng)性符合要求。因此實(shí)驗(yàn)中選擇流動(dòng)相梯度起始比例的溶劑0.2%甲酸∶乙腈=20∶80作為進(jìn)樣溶劑。

3.2 SPE柱的選擇 可樂(lè)定和賽庚啶均屬于堿性藥物，可選擇對(duì)堿性藥物具有高選擇性MCX小柱凈化。同時(shí)我們還比較了HLB固相萃取小柱的凈化效率，比MCX小柱略低，因此最終選擇了MCX小柱進(jìn)行固相萃取凈化。

3.3 流動(dòng)相的選擇 通過(guò)比較三種常見(jiàn)流動(dòng)相甲醇、甲醇∶水(1 ∶1，V/V)、乙腈:0.2% 甲酸，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中未加入0.2%甲酸的情況下，可樂(lè)定和賽庚啶的電離效果較差，峰型對(duì)稱(chēng)性差，在加入一定比例的0.2%甲酸后，得到了改善，因此最終選擇乙腈:0.2%甲酸作為流動(dòng)相。通常因?yàn)轱暳蠘悠分谢|(zhì)干擾較大，在流動(dòng)相條件中設(shè)置梯度條件可避免樣品中的基質(zhì)干擾，使得定性和定量更加準(zhǔn)確。

3.4 色譜柱的選擇 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相較于普通的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜具有分離速度快、靈敏度高等分離特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)，在方法研制過(guò)程中，我們選用了兩款適合超高效液相色譜使用的色譜柱Aglient公司生產(chǎn)的 SB C18100 mm ×3.0 mm，粒徑1.8 μm以及Waters公司生產(chǎn)的BEH C18100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm 進(jìn)行比較?？蓸?lè)定藥物極性強(qiáng)，不易保留，經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)SB C18柱可以提供更好的保留和分離效果，因此最終選擇SB C18色譜柱進(jìn)行本次檢測(cè)方法研究。

3.5 實(shí)際樣品檢測(cè) 在2010年飼料預(yù)警預(yù)測(cè)工作中，我所利用本方法對(duì)采集到的447批次樣品進(jìn)行了檢測(cè)，共檢出25批次陽(yáng)性樣品，從陽(yáng)性樣品的分析結(jié)果可以看出，目前可樂(lè)定和賽庚啶在配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料各類(lèi)型中均存在違法添加的情況。全部陽(yáng)性樣品中，配合飼料中可樂(lè)定的添加范圍為0.1～0.9 mg/kg，賽庚啶的添加范圍為0.2～1.3 mg/kg，濃縮飼料和預(yù)混合飼料中可樂(lè)定的添加范圍為1.2～1.4 mg/kg，賽庚啶的添加范圍為1.0～19.0 mg/kg。另根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在飼料中添加0.5 mg/kg可樂(lè)定時(shí)，即能明顯改變豬的胴體組成，因此本方法的定量限和檢測(cè)限的均能夠滿足要求。

［1］王 珊，寧 聰，魏 虹，等.可樂(lè)定促生長(zhǎng)作用的臨床觀察［J］.實(shí)用兒科雜志，1992，7(4):218-219.

［2］曹建平，徐建國(guó).可樂(lè)定麻醉鎮(zhèn)痛應(yīng)用及機(jī)制［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)-麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊(cè)，2001，22(2):104-107.

［3］張慶柱，耿金榮.賽庚啶的藥理與臨床研究進(jìn)展［J］.中級(jí)醫(yī)刊，1996，31(3):47-49.

［4］王雷杰，占秀安，許梓榮，等.可樂(lè)定對(duì)生長(zhǎng)豬胴體組成的影響及其作用機(jī)理探討［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2005，31(5):654-658.

［5］馮 杰，余東游.可樂(lè)定對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)激素分泌的影響［J］.飼料研究，2000(9):24-25.

［6］Weng N，Bu H，Chen Y，et al.Simultaneous Development of Six LC-MS-MS Methods for the Determination of Multiple Analytes in Human Plasma［J］，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2002，28(6):1115-1126.

［7］Fente C A，Regal P，Beatriz I，et al.Development and Validation of an LC-MS/MS Confirmatory Method for Residue Analysis of Cyproheptadine in Urine of Food-Producing Animals［J］.J Agric Food Chem，2009，57(6):2595-2598.

［8］Xesús F，Lei Y，Seyed V H，et al.Development and Validation of LC-MS/MS Method for the Determination of Cyproheptadine in SeveralPharmaceuticalSyrup Formulations［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，50(5):1044-1049.

［9］曹 瑩，蔣 音，嚴(yán) 鳳.高效液相色譜法分析飼料中的“可樂(lè)定”［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010，6:27-28.

［10］曹 瑩，蔣 音，張文剛.高效液相色譜法分析飼料中的賽庚啶［J］.中國(guó)飼料，2011，2:39-40.