秦蕓樺，張 濤，江 波，*

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

纖維蛋白溶解酶SPFE-I的溶栓活性及纖溶機理研究

秦蕓樺1，2，張 濤1，江 波1，*

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

采用體外實驗和SDS-PAGE電泳法對纖維蛋白溶解酶SPFE-I的溶栓活性、抗凝活性及纖溶機理進行了研究。體外實驗證明，該酶終濃度為0.12U/mL時具有體外抗凝血作用，血塊在1.5U/mL酶液中的溶解率為72%；采用SDSPAGE電泳法研究發(fā)現(xiàn)，該酶可以水解纖維蛋白原的β、γ鏈，激活纖維蛋白溶酶原形成纖維蛋白溶解酶，并降解纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1。

纖維蛋白溶解酶-I，溶栓，纖溶機理

1 材料與方法

1.1 材料與設備

SPFE-I 本實驗室制備；牛血纖維蛋白原、纖維蛋白溶解酶原、凝血酶 中國生物制品檢定所；低分子量標準蛋白 中國科學院生物化學所；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

PowerPac Basic電泳設備 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗凝血實驗 小鼠眼球采血，分別取不同濃度的SPFE-I酶液1mL加入1mL血液中；另取一組生理鹽水做比對實驗；輕輕混勻后，37℃溫箱孵育；每隔3h取出，觀察血液的凝固狀態(tài)[7]。

1.2.2 血凝塊溶解實驗 小鼠眼球采血，4℃自然凝固，濾紙吸干血栓表面，切成約0.2g的小塊；加入1mL酶液（1.5U/mL），37℃下90r/min離心6h，測定凝血塊的溶解率[7]；對照組加入1mL生理鹽水。

1.2.3 纖維蛋白酶原的激活作用 將SPFE-I（終濃度為10μg/mL）加入至10mg/mL的纖維蛋白溶解酶原溶液，在37℃的恒溫器中溫育，于0、15、30、60、120min時不同時間取樣。用SDS-APGE（分離膠濃度為10%）檢測。

1.2.4 纖維蛋白原的水解作用 將SPFE-I（終濃度為10μg/mL）加入到10mg/mL的纖維蛋白原溶液中，在37℃的恒溫器中溫育，于0、5、15、30、60、120、180min時取樣，用SDS-APGE（分離膠濃度為10%）檢測。

1.2.5 對降解纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1的降解作用 將SPFE-I（終濃度為10μg/mL）加入至10mg/mL的凝血酶溶液，在37℃的恒溫器中溫育，于60min時取樣。用SDS-APGE（分離膠濃度為10%）檢測。

1.2.6 SDS-PAGE分析 濃縮膠4%，分離膠濃度10%，酶液與樣品緩沖液混合后，沸水浴中加熱3min后上樣，電泳條件為恒電流20mA。電泳后分離考馬斯亮藍R250（0.1%）染色顯現(xiàn)蛋白帶，甲醇∶乙酸∶水（1∶8∶8）脫色。

2 結果與討論

2.1 SPFE-I的抗凝血實驗結果分析

血液中存在兩個對立統(tǒng)一的系統(tǒng)：凝血系統(tǒng)和溶血系統(tǒng)，在正常情況下，二者處于平衡狀態(tài)，既保證血液在血管中暢通無阻，又保證一旦血管壁破損能夠及時堵漏；在病理情況下，凝血系統(tǒng)功能亢進或纖溶系統(tǒng)功能降低，就形成血栓或有形成血栓的傾向。從表1可知，加入SPFE-I（終濃度為0.725U/mL）的試管沒有凝血；加入SPFE-I（終濃度為0.12U/mL）的試管有部分血塊出現(xiàn)；加入生理鹽水的試管血液全部凝固。此實驗說明了SPFE-I具有抗凝血作用，臨界濃度大約是0.12U/mL。

表1 纖溶酶抗凝血作用

2.2 SPFE-I的血凝塊溶解實驗結果分析

血栓是指在活體的心臟和血管內血液凝固而形成的凝塊。正常情況下人體內的血液是不會凝固的，因為在人體內有抗凝血因子和凝血因子相互制約。一旦這種相互制約關系受到干擾或破壞，就會出現(xiàn)病理現(xiàn)象，產(chǎn)生血栓。本實驗加入酶液組血凝塊溶解率為72%，對照組為12.5%，說明該纖維蛋白溶解酶具有使血凝塊溶解的作用。

2.3 SPFE-I對纖溶酶原的激活作用

在生理條件下纖維蛋白溶解酶原在激活劑的作用下形成血纖維蛋白溶解酶，血纖維蛋白溶解酶能水解血栓中的纖維蛋白，形成可溶性降解產(chǎn)物，從而使血栓溶解。本實驗室曾利用加熱平板法證明，該酶具有激活纖維蛋白溶解酶原形成纖維蛋白溶解酶，間接降解纖維蛋白的作用，本實驗利用SDS-PAGE證明其作用機理。由圖2可知，SPFE-I將纖溶酶原降解成若干個片段a、b、c、d、e、f，其中片段a、d、f呈逐漸減少趨勢，片段c先增多后減少，片段e呈現(xiàn)增多趨勢，可能是血纖維蛋白溶解酶，但具體的酶切位點仍需進一步論證。

圖1 纖溶酶原激活效果圖

2.4 SPFE-I對纖維蛋白原的水解作用

纖維蛋白原是體內血栓的主要組成成分之一，它的分子是由三對兩兩相同的肽鏈（α、β、γ鏈）組成的二聚體；66.2ku處為α鏈，43.0ku與66.2ku之間是β鏈，43.0ku處為γ鏈。由圖2可知，SPFE-I具有水解纖維蛋白原的作用，水解主要集中在β、γ鏈，沒有水解α鏈。

圖2 纖維蛋白原水解效果圖注：M：marker；1：纖維蛋白原；2～8：0、5、15、30、60、120、180min時的水解狀況。

2.5 SPFE-I對降解纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1的降解作用

圖3 SPFE-I對降解纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1的降解作用注：1：低分子量標準蛋白；2：纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1；3：纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1+SPFE-I。

纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1是組織型纖溶酶原激活劑的主要抑制劑，在纖維蛋白溶解作用的初級階段調節(jié)脈管系統(tǒng)中的纖溶活性。體內的纖維蛋白溶解活性是由組織型纖溶酶原激活劑和纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1的平衡決定的，但也可以通過纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1和血漿中絲氨酸蛋白酶的相互作用改變[8]。

從圖3中可以看出，SPFE-I可以降解纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1，也就是說可以解除纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1對tPA的抑制作用，間接地促進了溶解酶原激活纖維蛋白溶解酶，從而促進了纖維蛋白的水解。纖維蛋白是體內血栓的主要成分之一，SPFE-I降解纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1，從而可以間接促進體內血栓的溶解。

3 結論

經(jīng)研究證明，纖溶酶SPFE-I具有溶解血栓的作用，在濃度1.5U/mL時血凝塊溶解率為72%；同時具有抗凝血作用，臨界濃度大約是0.12U/mL。采用SDSPAGE電泳法研究其機理，表明它有三種作用方式：直接降解纖維蛋白的作用；激活纖溶酶原，從而間接降解纖維蛋白；降解纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1，也就是說可以解除纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑-1對tPA的抑制作用，間接地促進了溶解酶原激活纖維蛋白溶解酶，從而促進了纖維蛋白的水解。因此，該酶是一種很有開發(fā)潛力的溶栓酶。

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Study on thrombolysis activity and fibrinolytic mechanism of SPFE-I

QIN Yun-hua1,2,ZHANG Tao1,JIANG Bo1,*
（1.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China；2.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China）

Thrombolysis activity，anticoagulation activity and fibrinolytic mechanism of SPFE-I were studied by vivo experiment and SDS-PAGE.As a result，the enzyme had the function of anticoagulation in 0.12U/mL，and dissolving rate of blood clots in 1.5U/mL was 72%；β and γ-chains of fibrinogen were cut off by SPFE-I，plasminogen could be activted to from plasmin and plasminogen activator inhibitor-I was also able to be degraded by it.

fibrinolytic enzyme；thrombolysis；fibrinolytic mechanism

TS201.4

A

1002-0306（2011）10-0412-03

人體內的溶栓系統(tǒng)包括了纖維蛋白溶解酶原、纖維蛋白溶解酶、纖維蛋白溶解酶原激活劑和纖維蛋白溶解酶原激活劑抑制劑。體內的不溶性纖維蛋白會在血纖維蛋白溶解酶的作用下被降解為可溶性的降解物，而血纖維蛋白溶解酶是由纖維蛋白溶解酶原在纖維蛋白溶解酶原激活劑的作用下形成的。目前，國內外主要的溶栓劑有尿激酶、鏈激酶、組織性纖維蛋白溶解酶原激活劑等，其價格高昂，還有一定的副作用[1-2]，因而，尋找安全廉價的溶栓劑一直是研究的熱點。目前，從發(fā)酵食品中篩選得到的溶栓劑有納豆中的納豆激酶[3]，韓國豆餅醬中的枯草激酶[4]，豆豉中的纖維蛋白溶解酶等[5]。本實驗室從亞洲傳統(tǒng)的食品——發(fā)酵蝦醬中篩選到菌種Bacillus sp.nov SK006[6]，該菌種產(chǎn)有多種具有纖溶作用的纖維蛋白溶解酶，本文就其中一種纖維蛋白溶解酶SPFE-I的體外溶栓活性及其機理進行了研究。

2011-04-25 *通訊聯(lián)系人

秦蕓樺（1982-），女，博士研究生，研究方向：食品生物技術。

國家自然科學基金項目（20976073）；江南大學校內自主科研項目（JUSRP21107）。