付 敏，趙謀明，*，劉 寧，汪 勇

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641；2.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

吸附-涂層法固定化磷脂酶Lecitase?Ultra的研究

付 敏1，趙謀明1，*，劉 寧1，汪 勇2

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641；2.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

比較了7種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)磷脂酶Lecitase?Ultra的固定化效果，對(duì)固定化條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，極性樹(shù)脂DA201為該酶的最適固定化載體，在室溫下，以pH 7.0，0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液為媒介，加酶量30mg/g樹(shù)脂，采用正硅酸乙酯對(duì)經(jīng)真空干燥的固定化酶進(jìn)行涂層處理，通過(guò)電鏡掃描發(fā)現(xiàn)其涂層效果較好。在最適條件下得到的固定化酶活力為1250～1300U/g，連續(xù)操作5次后酶活保存率為55%。與游離酶比較，固定化磷脂酶Lecitase?Ultra的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性均有一定程度的提高。

磷脂酶Lecitase?Ultra，大孔吸附樹(shù)脂，涂層，固定化，穩(wěn)定性

Lecitase?Ultra是諾維信公司推出的一種微生物來(lái)源的磷脂酶，該酶是一種羧酸酯水解酶，同時(shí)具有脂肪酶活性和磷脂酶活性。在一定反應(yīng)體系中，它會(huì)優(yōu)先表現(xiàn)出其中一種特定的酶活[1]，比如脂肪酶活性。和同類脂肪酶相比，該酶類的脂肪酶活力高，價(jià)格便宜，具有很好的應(yīng)用前景[2]。但由于游離磷脂酶Lecitase?Ultra催化反應(yīng)時(shí)不易回收，條件苛刻，其應(yīng)用受到了很大的限制。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，還具有貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，因此成為酶工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究之一[3]。樹(shù)脂吸附法[4]是上世紀(jì)80年代逐漸發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，它可通過(guò)氫鍵和疏水作用力與酶分子結(jié)合，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)影響較小，同時(shí)可以維持脂肪酶在非水體系中發(fā)揮活性的微環(huán)境，大大提高其催化活性，非常適用于脂肪酶類的固定化[5]。磷脂酶Lecitase?Ultra同時(shí)具有脂肪酶和磷脂酶活力，其脂肪酶活力方面有著巨大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[6]。本實(shí)驗(yàn)著重研究了基于其脂肪酶方面活力的固定化條件，選用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行固定化，對(duì)固定化工藝條件進(jìn)行了研究，并探討了固定化酶的穩(wěn)定性，以期為其在生物催化方面的深入應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷脂酶Lecitase?Ultra 脂肪酶活力3326U/g（測(cè)定方法見(jiàn)1.2.4），丹麥諾維信公司；大孔吸附樹(shù)脂 天津海光化工有限公司；三丁酸甘油酯 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；氫氧化鉀、鹽酸等試劑 均為分析純。

754型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；S20 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；DZF-6000型真空干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；S-3700N掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 載體樹(shù)脂的預(yù)處理 參考文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。

1.2.2 磷脂酶Lecitase?Ultra的固定化 稱取一定量的游離磷脂酶Lecitase?Ultra、Tris-HCl緩沖液和大孔吸附樹(shù)脂，置于磁力攪拌器上恒溫吸附4h，過(guò)濾分離載體和上清液，將載體真空干燥至恒重后存于-4℃中待用，上清液留待吸附率測(cè)定。

1.2.3 載體樹(shù)脂的蛋白吸附量測(cè)定 蛋白質(zhì)含量采用Folin-酚法測(cè)定。吸附量和吸附率的公式分別為：

式中：X1：吸附前酶液的蛋白含量（mg）；X2：吸附后酶液的蛋白含量（mg）；W：加入樹(shù)脂的量（g）。

1.2.4 固定化磷脂酶Lecitase?Ultra活力的測(cè)定 磷脂酶Lecitase?Ultra的脂肪酶活力采用水解三丁酸甘油酯pH-stat法[8]測(cè)定。酶活定義為，在一定條件下，1min水解三丁酸甘油酯產(chǎn)生1μmol丁酸所需的酶量，即為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.5 掃描電鏡 對(duì)固定化酶顆粒噴金后，進(jìn)行電鏡掃描，加速電壓為10kV，放大倍率為5000倍。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化載體的選擇

選取7種不同特性的樹(shù)脂作為磷脂酶Lecitase? Ultra的固定化載體。固定化條件為：pH7.0的0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，加酶量30mg/g樹(shù)脂，室溫振蕩吸附12h，經(jīng)真空干燥后，測(cè)定各樹(shù)脂的吸附率及固定化酶活力，結(jié)果如表1所示。

表1 不同樹(shù)脂對(duì)磷脂酶Lecitase?Ultra的固定化效果

大孔樹(shù)脂可以借助氫鍵、范德華力或者功能基團(tuán)將酶分子固定化，樹(shù)脂的物理化學(xué)性質(zhì)是影響固定化能力和催化效率的重要因素[5]。由表1可看出，極性樹(shù)脂DA201的吸附率及吸附固定化所得酶的酶活相對(duì)較高。該極性樹(shù)脂的固定化效果明顯優(yōu)于其他非極性和弱極性樹(shù)脂的固定化效果，它的比表面積和孔徑適中，顆粒均勻，利于固定化和樹(shù)脂的回收利用。綜合考慮，選用DA201樹(shù)脂作為磷脂酶Lecitase? Ultra的固定化載體。

2.2 磷脂酶Lecitase?Ultra的固定化條件研究

2.2.1 最適固定化pH的研究 在特定的pH下，酶分子上的活性基團(tuán)才能處于最佳的解離狀態(tài)，呈現(xiàn)較好的催化活力。本實(shí)驗(yàn)研究了不同pH的0.01mol/L Tris-HCl緩沖液對(duì)固定化酶的酶活及吸附率的影響，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯觯S著pH不斷上升，酶活及吸附率先緩慢升高，在pH為7.0時(shí)，達(dá)到最高，隨后隨著pH上升又緩慢下降。因此最終選擇pH7.0作為酶固定化的最適pH。

圖1 不同pH對(duì)酶活和吸附率的影響

2.2.2 最適加酶量的研究 實(shí)驗(yàn)研究了加酶量對(duì)固定化磷脂酶Lecitase?Ultra活力及吸附率的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著加酶量的增加，吸附率呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)加酶量達(dá)到30mg/g樹(shù)脂時(shí)吸附率最高，隨著加酶量的繼續(xù)增加，吸附率下降。而酶活在30mg/g樹(shù)脂時(shí)同時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸趨于恒定?？赡茉蚴羌用噶枯^少時(shí)，吸附酶量較低，則酶活力低；當(dāng)被吸附酶液濃度升高，酶分子吸附較多，固定化酶活也變大；隨著加酶量進(jìn)一步增加，樹(shù)脂孔道被“堵塞”，產(chǎn)生了空間位阻，固定化酶活也就趨于恒定[9]。綜合考慮，選取30mg/g樹(shù)脂為最適加酶量。

圖2 不同加酶量對(duì)酶活和吸附率的影響

2.2.3 固定化酶的交聯(lián)或涂層處理研究 本實(shí)驗(yàn)分別采用戊二醛、正硅酸乙酯對(duì)經(jīng)真空干燥的固定化酶進(jìn)行交聯(lián)或涂層處理，以提高其操作穩(wěn)定性。其中戊二醛和正硅酸乙酯的濃度分別為0.1%和30%[10]。經(jīng)上述處理后，固定化酶真空干燥，再對(duì)其進(jìn)行電鏡掃描，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，較對(duì)照組而言，交聯(lián)或涂層處理對(duì)固定化酶的表面改性均較明顯。通過(guò)酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)交聯(lián)或涂層后固定化酶的酶活分別降低了18%和10%左右，這可能是外加處理?yè)p失了一定的酶活。相對(duì)交聯(lián)法而言，涂層法對(duì)酶有一定的包裹保護(hù)作用，酶活損失較小一些。

圖3 不同處理方式下固定化酶的掃描電鏡圖

2.3 固定化酶的穩(wěn)定性研究

2.3.1 不同處理方式下固定化酶操作穩(wěn)定性的研究以對(duì)照組的固定化酶活為100%，測(cè)定連續(xù)使用5次后的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖4所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，在重復(fù)使用過(guò)程中，經(jīng)戊二醛交聯(lián)處理或正硅酸乙酯涂層處理的固定化酶的操作穩(wěn)定性明顯優(yōu)于對(duì)照組。正硅酸乙酯涂層處理的效果更好，重復(fù)使用5次之后，仍然保有55%左右的酶活，而戊二醛交聯(lián)和對(duì)照組只有初始酶活的25%。主要原因是，經(jīng)正硅酸乙酯涂層處理，吸附在樹(shù)脂孔隙中的酶被包裹在正硅酸乙酯所形成的涂層里（見(jiàn)圖3-C），使用過(guò)程中不易脫落下來(lái)[10]，從而具備較好的操作穩(wěn)定性。因此，最終確定吸附-涂層法對(duì)磷脂酶Lecitase?Ultra進(jìn)行固定化處理。經(jīng)測(cè)定，此法得到的固定化磷脂酶Lecitase? Ultra的酶活為1250～1300U/g。

圖4 不同處理方法對(duì)固定化酶操作穩(wěn)定性的影響

圖5 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性

2.3.2 固定化酶的熱穩(wěn)定性研究 分別將游離酶和固定化酶在不同溫度下處理1h，定義未經(jīng)熱處理的酶活為100%，各相對(duì)酶活變化如圖5所示。由圖可知，固定化之后，酶的耐熱性能更好，在55℃下處理1h仍能保持60%左右的酶活，從而可使一些需要在相對(duì)較高溫的環(huán)境中反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)得以進(jìn)行。在低于45℃對(duì)游離酶和固定化酶進(jìn)行保溫處理，酶活力損失較少；高于45℃對(duì)游離酶和固定化酶進(jìn)行保溫處理，酶活力則呈明顯下降趨勢(shì)，游離酶活力下降十分迅速。這主要是由于固定化穩(wěn)定了酶分子構(gòu)象，從而減少了熱導(dǎo)致構(gòu)象變化的可能性[11]，大孔吸附樹(shù)脂的保護(hù)作用也在一定程度上屏蔽了高溫對(duì)磷脂酶Lecitase?Ultra的影響，提高了酶分子的抗熱失活能力。2.3.3 固定化酶的pH穩(wěn)定性研究 在相同條件下分別將游離酶和固定化酶在不同pH下處理2h，定義未經(jīng)處理的酶活為100%，各相對(duì)酶活變化如圖6所示。由圖可知，固定化之后酶的pH穩(wěn)定性提高，耐酸堿范圍變寬。游離酶在高于pH6.5體系處理后，酶活急劇下降；而固定化酶在高于pH7.5環(huán)境處理后，依然保持較高的酶活。整體看來(lái)，固定化酶的pH穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶，且能耐受稍堿性的環(huán)境。這是因?yàn)椋冈诠潭ɑ院?，酶活性中心氨基酸帶電情況發(fā)生了變化，從而影響了酶的活性[12]，因此利于某些特定條件下的使用，擴(kuò)大了其實(shí)際應(yīng)用范圍。

圖6 固定化酶和游離酶的pH穩(wěn)定性

3 結(jié)論

以大孔吸附樹(shù)脂DA201為載體，對(duì)磷脂酶Lecitase? Ultra進(jìn)行吸附法固定化，具體方法為：室溫下，以pH7.0 0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液為媒介，加酶量30mg/g樹(shù)脂，吸附時(shí)間4h。真空干燥后，用正硅酸乙酯涂層處理，可得到固定化酶的酶活為1250～1300U/g。重復(fù)使用5次后，酶活回收率可達(dá)55%。固定化酶較游離酶具有更廣泛的應(yīng)用條件，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，適用pH范圍增大，從而擴(kuò)大了磷脂酶Lecitase?Ultra的使用效率和應(yīng)用范圍。

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Immobilization of Lecitase?Ultra by adsorption-coating method and its properties

FU Min1,ZHAO Mou-ming1，*,LIU Ning1,WANG Yong2
（1.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510641,China；2.Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China）

Seven kinds of macroporous resin were employed to immobilize phospholipase Lecitase?Ultra，and the immobilization conditions were studied.The results indicated that DA201 was the best carrier.The optimum operation conditions were:under room temperature，pH 7.0 Tris-HCl（0.01mol/L），enzyme dosage 30mg/g resin.Tetraethyl orthosilicate was then used as the coating reagent for immobilized enzyme by the vacuum drying，which showed an effective coating effect through scanning electron microscope.Under optimized conditions，the immobilized Lecitase?Ultra with enzyme activity of 1250～1300U/g could be obtained，and it could remain 55%enzyme activity after continuous operation for 5 times.Compared with free Lecitase?Ultra，there was a certain extent improvement for the thermal stability and pH stability of immobilized Lecitase?Ultra. Key words：Lecitase?Ultra；macroporous adsorption resin；coating；immobilization；stability

TS201.2+5

B

1002-0306（2011）10-0277-04

2010－11－19 *通訊聯(lián)系人

付敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2010AA101505）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31000793）。