宋景深，陳振鵬，鄧寶浣，陳子健

（江門量子高科生物股份有限公司，廣東江門529081）

固定化β-半乳糖苷酶的催化特性研究

宋景深，陳振鵬，鄧寶浣，陳子健

（江門量子高科生物股份有限公司，廣東江門529081）

β-半乳糖苷酶經(jīng)固定化后，其催化性能得到一定程度的改善。在各種反應(yīng)條件相同的條件下，固定化酶的最適反應(yīng)條件與游離酶相比得到一定程度的拓寬：受反應(yīng)溫度變化的影響變小，pH從5.8～6.2擴寬至5.7～6.5；對乳糖的轉(zhuǎn)化效率有了不少的提高，酶的穩(wěn)定性也得到了加強。實驗中固定化β-半乳糖苷酶重復(fù)使用28次，底物轉(zhuǎn)化率均在45%以上，具備了一定實際應(yīng)用能力。

β-半乳糖苷酶，固定化，催化特性

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，簡稱GOS）可以促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌（Bifidobacteria）和乳酸桿菌等有益菌的生長，是一種益生元（prebiotics）。低聚半乳糖是以乳糖為原料，經(jīng)β-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）作用轉(zhuǎn)化而成[1]?？蓪ⅵ?半乳糖苷酶固定化，固定化酶具有催化效率高、穩(wěn)定性高、低能耗、低污染等優(yōu)點，將β-半乳糖苷酶固定化后用于生產(chǎn)，可提高酶的利用率，節(jié)省生產(chǎn)成本。本研究中固定化酶是以樹脂為載體，經(jīng)吸附作用制作而成。酶被固定化以后，由于受到多方面的影響，與游離酶相比較，其微觀結(jié)構(gòu)等往往會發(fā)生改變，對底物的轉(zhuǎn)化特性也可能隨之而變[2]。如：受擴散現(xiàn)象影響，酶固定在多孔載體，由于受到質(zhì)量傳遞限制，酶活力可能會受到擴散現(xiàn)象影響；受空間構(gòu)型影響，因酶的比活力非常依賴于所用載體的本身性質(zhì)，另外酶固定化疏水性載體和親水性載體的差異性很大；受微環(huán)境影響，微環(huán)境是指吸附的酶分子周圍的載體性質(zhì)，其可能會對酶的特性產(chǎn)生影響；受載體孔徑大小影響，載體孔徑過小，酶無法進(jìn)入被吸附或者吸附后容易受到擴散限制；載體孔徑過大，酶被吸附后有可能引起酶構(gòu)型的改變。可見，酶在固定化以后可能會受到多個方面的影響，固定化酶的特性與游離酶相比較可能發(fā)生變化。本研究在以上理論基礎(chǔ)上，摸索β-半乳糖苷酶被樹脂固定化后的性質(zhì)變化情況，觀察對乳糖轉(zhuǎn)化的特性是否受到影響，各轉(zhuǎn)化參數(shù)是否有變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-半乳糖苷酶 江門量子高科生物股份有限公司；吸附樹脂 天津南開和成科技有限公司；乳糖購自戴維林國際貿(mào)易有限公司（荷蘭DMV乳糖）；蒸餾水 自制；0.5mmol的氫氧化鈉溶液 自配；pH6.0緩沖液 磷酸緩沖液（自配）。

水浴搖床 常州澳華儀器有限公司；可調(diào)電爐長沙市遠(yuǎn)東電爐廠；三角瓶、燒杯、玻棒 購自江門國僑科技儀器公司。

1.2 實驗方法

轉(zhuǎn)化率檢測方法參照低聚半乳糖的高效液相色譜測定法[3]，轉(zhuǎn)化率（%）以低聚半乳糖含量計。

轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響因素主要有底物濃度、反應(yīng)液pH、反應(yīng)溫度、攪拌速度等。固定化酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)低聚半乳糖反應(yīng)條件確定主要從這些因素著手。研究中比較游離酶的各反應(yīng)條件，觀察酶被固定化以后反應(yīng)特性是否發(fā)生了變化。

固定化酶的制備：用250mL三角瓶稱取3g的吸附樹脂，加入100mL蒸餾水后放入搖床，室溫條件下?lián)u動活化2h，取出后將蒸餾水倒干凈；量取10mL緩沖液（pH6.0）轉(zhuǎn)入100mL三角瓶，吸取總活力500U的液態(tài)β-半乳糖苷酶加入三角瓶，溶于緩沖液；將完成活化的樹脂倒入裝有酶液的三角瓶，然后置于6℃冷凍搖床搖動吸附，吸附24h。完成吸附后倒掉吸附殘留液，用蒸餾水將固定化酶清洗干凈。制作若干份固定化酶，存放于4℃冰箱，待用。

1.2.1 pH對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響研究 用三角瓶分別配制兩組乳糖溶液，每組各5份，干物質(zhì)濃度50%±1%（50g乳糖+50mL蒸餾水），加熱完全溶解后降溫至55℃，然后使用氫氧化鈉溶液將其中4份乳糖溶液的pH調(diào)至5.0±0.1、6.0±0.1、7.0±0.1，另外一份乳糖溶液保留在自然pH（4.2），兩組操作相同，以作對比。在第一組的五份乳糖溶液中加入4mL游離酶（125U/mL），在第二組的五份乳糖溶液中加入3g固定化酶（166U/g），然后將所有乳糖溶液置于同一水浴搖床進(jìn)行酶解反應(yīng)，控制溫度55℃，反應(yīng)過程每隔1h用氫氧化鈉溶液校對一次pH。

1.2.2 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率的影響研究 設(shè)定四個溫度梯度：50、55、60、65℃，用三角瓶分別配制兩組乳糖溶液，每組各4份，濃度50%±1%（50g乳糖+50mL蒸餾水），加熱完全溶解，降溫至60℃后在第一組的4份乳糖溶液中加入4mL游離酶（125U/mL），在第二組的4份乳糖溶液中加入3g固定化酶（166U/g），然后分別置于50、55、60、65℃水浴搖床中。

1.2.3 底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響研究 配制兩組乳糖溶液，每組各4份，濃度分別為40%±1%、45%±1%、50%±1%、55%±1%，加熱完全溶解后降溫至60℃時在第一組的4份乳糖溶液中分別加入4mL游離酶（125U/mL），在第二組的4份乳糖溶液中分別加入3g固定化酶（166U/g），兩組反應(yīng)液都置于65℃水浴搖床進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.4 米氏常數(shù)Km的測定 分別在兩組4個250mL的三角瓶中用pH6.0的磷酸鹽緩沖液分別配制0.0585、0.0877、0.1170、0.1462mol/L的乳糖溶液，在兩組溶液中分別加入相同的總酶量50U的游離酶和固定化酶，在65℃下反應(yīng)60min，分別測定其生成含量最高的轉(zhuǎn)移三糖的量，并計算反應(yīng)速度。

1.2.5 酶的半衰期測定 分別稱量2份游離酶和2份固定化酶，每份游離酶4mL，每份固定化酶3g，分別放入pH6.0的醋酸鹽緩沖液中，置于65℃條件下進(jìn)行保溫，分別在保存的第0、5、10、15d取出一份游離酶和一份固定化酶進(jìn)行酶活檢測，據(jù)此測定游離酶和固定化酶的半衰期。

1.2.6 固定化酶使用壽命的測定 在250mL中配制固形物含量50%的乳糖溶液，加入3g固定化酶，置于65℃水浴搖床搖動反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)液中GOS含量達(dá)到45%以上，停止反應(yīng)；回收固定化酶，重復(fù)上述步驟，直至GOS含量低于45%。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)16h后每隔2h分別從兩組反應(yīng)液中取樣，取樣后第一組反應(yīng)液升溫至100℃滅酶1min，第二組反應(yīng)液用紗布濾去固定化酶，然后用高效液相色譜檢測轉(zhuǎn)化率，比較游離酶和固定化酶在不同pH條件下的乳糖轉(zhuǎn)化率，直至轉(zhuǎn)化率開始下降，停止取樣。每一份反應(yīng)液都是在進(jìn)行到24h后轉(zhuǎn)化率最高，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行，部分的低聚半乳糖將分解成單糖，而且隨著時間的推移，低聚半乳糖的損失增多。

圖1 反應(yīng)液pH對游離酶和固定化酶轉(zhuǎn)化效率的影響

從圖1可見，酶在被固定化以后最適pH有所偏移，游離酶的最適pH為5.8～6.2，而固定化酶的最適pH為5.7～6.5，最適pH范圍更寬。另外，從圖中可見，與游離酶比較，在相同的條件下，固定化酶催化乳糖轉(zhuǎn)化的效率更高。

2.2 反應(yīng)溫度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)24h后取樣，第一組反應(yīng)液升溫至100℃滅酶1min，第二組反應(yīng)液用紗布濾去固定化酶，然后用高效液相色譜檢測轉(zhuǎn)化率，比較游離酶和固定化酶在不同溫度條件下的乳糖轉(zhuǎn)化率。

圖2 反應(yīng)溫度對游離酶和固定化酶轉(zhuǎn)化效率的影響

從圖2的結(jié)果來看，隨著反應(yīng)溫度的升高，在相同的反應(yīng)時間內(nèi)，游離酶和固定化酶對乳糖的轉(zhuǎn)化率都升高，因為所用的酶為耐高溫酶，可耐受溫度80℃以上，但考慮到載體樹脂所能耐受的溫度為65℃，設(shè)定固定化酶的最適反應(yīng)溫度為65℃。固定化酶和游離酶比較，隨著反應(yīng)溫度的下降，固定化酶的轉(zhuǎn)化率下降幅度較游離酶的小，從不同反應(yīng)溫度角度來說，酶經(jīng)大孔樹脂固定化以后穩(wěn)定性升高，受反應(yīng)溫度變化的影響較小。

2.3 底物濃度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

圖3 底物濃度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)24h后分別取樣檢測低聚半乳糖含量（轉(zhuǎn)化率），觀察在不同底物濃度條件下游離酶和固定化酶的乳糖轉(zhuǎn)化率。

從圖3可見，無論是游離酶或是固定化酶，底物濃度為40%、45%時乳糖轉(zhuǎn)化率較低，而當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%時乳糖轉(zhuǎn)化率最高，酶的固定化酶并沒有改變此特性。而在同一條件下，固定化酶受底物的影響更低，乳糖轉(zhuǎn)化率更高。

2.4 酶的動力學(xué)常數(shù)

以雙倒數(shù)作圖法測定游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)Km，如圖4，游離酶的Km=449mmol/L，Vmax= 4.560mmol·L-1·min-1；固定化酶的Km=289mmol/L，Vmax=3.605mmol·L-1·min-1。

圖4 游離酶和固定化酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

從動力學(xué)常數(shù)來看，β-半乳糖苷酶被固定化以后，對底物的親和力更強，催化乳糖轉(zhuǎn)化成低聚半乳糖的速度被提高。

2.5 半衰期檢測

圖5 時間與log（E/Eo）值對應(yīng)曲線

β-半乳糖苷酶酶活檢測方法參照文獻(xiàn)[10]中所描述的檢測方法，根據(jù)公式計算半衰期：t1/2=0.693/KD

式中：KD=-2.303/t·log（E/Eo），為衰減常數(shù)，其中E為第5、10、15d檢測酶活平均值，Eo為第0d檢測酶活平均值。

以時間與對應(yīng)的log（E/Eo）值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。

按照公式所計算出來的游離β-半乳糖苷酶半衰期為27d，而固定化β-半乳糖苷酶半衰期為34d，進(jìn)一步證明酶被固定化以后穩(wěn)定性提高。

2.6 固定化酶使用壽命

游離酶因為無法回收，所以只能使用一次，而固定化酶在間歇式反應(yīng)中可以通過分離來重復(fù)使用，隨著使用次數(shù)的增加，酶活力逐漸衰減。通過間歇式反應(yīng)實驗的觀察，證實一批固定化β-半乳糖苷酶可反復(fù)使用28次，每次反應(yīng)轉(zhuǎn)化率都在45%以上。

3 結(jié)論

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，與游離酶相比較，β-半乳糖苷酶經(jīng)固定化以后，酶的最適pH范圍產(chǎn)生了偏移，從5.8～6.2擴寬至5.7～6.5，而最適反應(yīng)溫度、最適底物濃度并沒有發(fā)生改變，但穩(wěn)定性比游離酶高，但在各種反應(yīng)條件相同的條件下，固定化酶比游離酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率更高。酶在固定化以后米氏常數(shù)Km變小，從游離酶時的449mmol/L變?yōu)楣潭ɑ蟮?89mmol/L；半衰期延長，比游離酶延長了7d，說明經(jīng)固定化以后酶的特性得到了進(jìn)一步改善。使用固定化酶方法生產(chǎn)低聚半乳糖，將很大程度上節(jié)省生產(chǎn)成本，提升生產(chǎn)效率，提高產(chǎn)品質(zhì)量，將推動低聚半乳糖甚至低聚糖行業(yè)在我國的進(jìn)一步發(fā)展。

[1]鄭健仙.功能性低聚糖[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：104-109.

[2]曹林秋.載體固定化酶-原理、應(yīng)用和設(shè)計[M].北京：化工出版社，2008：53-72.

[3]白鴻.保健食品功效成分檢測方法[M].北京：中國醫(yī)藥出版社，2011：103-110.

Study on catalytic characteristics of immobilizated β-galactosidase

SONG Jing-shen,CHEN Zhen-peng,DENG Bao-huan,CHEN Zi-jian
（Quantum Hi-tech Biological Co.,Ltd.，Jiangmen 529081，China）

Comparing to free enzyme，the catalytic characteristics of immobilizated β-galactosidase were modified.The ranges of optimum reactive conditions have been extended:the influence of temperature became smaller，pH widened to 5.7～6.5 from 5.8～6.2.The conversion rate of substrate becomes higher and the stability of enzyme has been enhanced.Having been re-used for 28 times，the conversion rate of substrate keeps being more than 45%.

β-galactosidase；immobilization；catalytic characteristics

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）10-0092-03

2011－08－12

宋景深（1979-），男，研究生，食品工程師，研究方向：低聚糖生產(chǎn)技術(shù)研究。