石嘉懌

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇南京210003）

青梅花提取物的酪氨酸酶抑制作用及機理研究

石嘉懌

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇南京210003）

目的：以青梅花為原料，探討其提取物（PF）在體外對酪氨酸酶的抑制作用及機理。方法：首先采用多巴速率氧化法體外測定PF酪氨酸酶的抑制活性，并繪制Lineweaver-Burk曲線，推斷其抑制類型。分別采用化學發(fā)光法和鐵氰化鉀還原法測定PF的清除自由基能力及還原力。結(jié)果表明：PF能顯著抑制酪氨酸酶活性，其半抑制濃度IC50為（98.89±6.34）μg/mL，抑制類型為混合型抑制。PF對酪氨酸酶的抑制作用可能與提取物中綠原酸等多酚物質(zhì)、較強的自由基清除能力和還原力有關(guān)。結(jié)論：PF是一種有前途的酪氨酸酶抑制劑，可應用于果蔬等食品的加工和貯藏。

青梅花，酪氨酸酶，自由基，還原力

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青梅花 為蕭山大青梅中的大葉青（Prunus mume，‘Da Ye Qing’）品種，采自浙江杭州市蕭山區(qū)進化鎮(zhèn)梅林，采摘后及時真空干燥（含水量在10%以下），室溫避光保存；酪氨酸酶、左旋多巴（L-DOPA） 美國Sigma-Aldrich公司，生化試劑；魯米諾（luminol） 瑞士Fluka公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）、無水乙醇等 均為國產(chǎn)分析純試劑。

MK3全自動酶標分析儀 芬蘭Thermo公司；Sirius單管式化學法共檢測儀 德國Berthold Detection Systems公司；TU-1810紫外可見（UV-VIS）分光光度儀 北京普析通用儀器有限公司；FA1004型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿，離心機，電熱恒溫水浴鍋、移液槍等實驗室常用設(shè)備。

1.2 實驗方法

1.2.1 青梅花提取物的制備 青梅花原料經(jīng)干燥，用萬能中藥粉碎機粉碎后過40目篩，取1kg，用30%（v/v）乙醇，料液比=1∶10（w/v），在60～70℃回流提取2h，按同樣的條件提取2次，合并兩次的提取液，經(jīng)減壓濃縮后采用冷凍干燥得到棕色粉末狀樣品，隨后真空密封包裝，經(jīng)輻照滅菌（輻射源為60Co-γ，輻射劑量為6kGy，）后在4℃冰箱中保存，供后續(xù)研究所需，青梅花提取物記作PF。

1.2.2 青梅花提取物中多酚、黃酮含量的分析 總酚按福林酚法[5]測定，以綠原酸為標準品；黃酮參照文獻[6]測定，以蘆丁為標準品。

1.2.3 青梅花提取物對酪氨酸酶活力的影響 以多巴（L-DOPA）為底物，按Huang等[7]的方法進行酪氨酸酶的活性測定。先將待測樣品用30%（v/v）的乙醇溶解，配成質(zhì)量濃度為1mg/mL的貯備溶液，再依次稀釋成不同濃度的樣品溶液。按表1所示，依次準確吸取不同濃度的樣品溶液、0.5mol/L pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液、0.5mmol/L的L-DOPA溶液和0.15mg/mL的酪氨酸酶溶液，充分混勻，在37℃的水浴鍋中孵育反應30min，然后立即測取各個試管中反應溶液在475nm處的吸光值。上述實驗均重復3次。

根據(jù)酶反應活性的定義，在一定的抑制劑濃度下，酶反應活性表示為ACTi，在沒有抑制劑時酶反應活性表示為ACT0，則受試樣品對酶的相對抑制率（I）可以定義為：

式中：A1、A2、A3、A4分別是1、2、3、4號反應液的吸光值。

表1 酶活力測定中反應液的組成（mL）

1.2.4 Fe2+-H2O2-魯米諾體系測定清除羥自由基（·OH）能力[8]利用Fe2+-H2O2-魯米諾發(fā)光體系產(chǎn)生·OH，以評價樣品·OH自由基清除能力，具體方法如下：

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：50mmol/L，pH=7.8，并含有0.1mmol/L的EDTA。魯米諾（Luminol）溶液：先用少量的1mmol/L的NaOH熔融后，再用PBS配制成濃度為0.2mmol/L的魯米諾溶液。用水配制成1.5%的雙氧水溶液和0.6mmol/L的硫酸亞鐵溶液。

按照預實驗的結(jié)果，用30%（v/v）的乙醇溶液配制成一定的適宜濃度梯度的待測樣品溶液，在發(fā)光管中先手動進樣50μL的樣品溶液（以加入50μL的30%（v/v）乙醇作為空白對照）和600μL的Luminol溶液，再用自動進樣器加入50μL雙氧水溶液和50μL的硫酸亞鐵溶液啟動反應，每隔6s記錄發(fā)光值，采集時間為30s，發(fā)光值由儀器所帶軟件自動對發(fā)光曲線進行積分得到。抑制率（I）的計算公式為：

式中：CL空白為空白的發(fā)光曲線積分面積，CL樣品為樣品組的發(fā)光曲線積分面積。

清除率為50%時的待測樣品濃度，定義為半抑制濃度（IC50）。以VC作為陽性對照，所有實驗均重復三次。

1.2.5 鐵氰化鉀還原法測定還原力 采用Dorman等[9]的方法進行還原力測定。在2.5mL pH=6.6的磷酸緩沖液中加入1mL待測液和1mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后將混合物在50℃下加熱20min后，急速冷卻，加入2.5mL 10%三氯乙酸，離心分離10min。取上層清液5mL，依次加入5mL水和1mL 0.1%氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10min后在波長710nm下測定吸光值（A）。A值越大，則樣品的還原力越強。以待測樣品濃度為橫坐標，以吸光值（A710）為縱坐標，繪制待測樣品還原力的曲線。根據(jù)曲線的回歸方程，計算得到吸光值（A710）為0.5時的待測樣品濃度（EC50）。

2 結(jié)果與討論

2.1 青梅花提取物中主要活性成分分析

按上述方法，分別測得青梅花提取物中總酚含量為（304.8±1.1）mg/g（以綠原酸計），黃酮含量為（249.2±1.3）mg/g（以蘆丁計）；在本項目的前期研究中已表明，綠原酸類物質(zhì)為青梅花提取物中的主要活性成分，經(jīng)HPLC方法測得其中綠原酸（CA）的含量為（26.76±0.04）μg/g[10]，所以在后續(xù)活性的研究中均將青梅花提取物（PF）和綠原酸（CA）進行了比較。

2.2 青梅花提取物對蘑菇酪氨酸酶活力的影響

圖1 青梅花提取物與綠原酸對酪氨酸酶的抑制率

2.2.1 青梅花提取物對蘑菇酪氨酸酶活力的影響 據(jù)報道綠原酸（CA）對酪氨酸酶有較好的抑制作用[11]，本研究的結(jié)果同樣表明青梅花提取物（PF）和綠原酸（CA）對蘑菇酪氨酸酶都具有明顯的抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴效應關(guān)系，即抑制率隨著樣品濃度的增大而增大。由樣品的抑制曲線求得PF、CA對蘑菇酪氨酸酶的半抑制濃度（IC50）分別為（98.89±6.34）、（180.47±6.74）μg/mL（見圖1）。值得注意的是，按照IC50判斷，青梅花提取物（PF）對酪氨酸酶的抑制效果要強于純的綠原酸（CA）。

2.2.2 青梅花提取物（PF）對蘑菇酪氨酸酶的抑制類型 已有文獻報道了綠原酸（CA）對酪氨酸酶的抑制類型為非競爭型抑制[12]，本研究進一步探討了青梅花提取物（PF）對酪氨酸酶的抑制機理。在測活體系中，固定加入的酶量，改變底物L-DOPA的濃度，測定酶在不同濃度青梅花提取物（PF）作用下的催化活力。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，可以判斷青梅花提取物對該酶的抑制作用類型。實驗結(jié)果如圖2所示，為一組相交在第二象限的直線。橫軸截距和縱軸截距都因效應物濃度的變化而改變，米氏常數(shù)（Km）隨效應物濃度的增大而變大，酶促反應的最大速度（Vm）則隨效應物濃度的增大而下降，其抑制類型屬于混合型。二次作圖，以雙倒數(shù)的斜率和縱軸截距對所含的效應物的濃度作圖為直線，分別求出PF對游離酶抑制常數(shù)（KI）為85.9μg/mL和對酶-底物絡(luò)合物抑制常數(shù)（KIS）為401.8μg/mL。

圖2 青梅花提取物抑制酪氨酸酶活力的雙倒數(shù)圖

2.3 青梅花提取物的清除·OH能力

圖3 青梅花提取物（PF）清除·OH的IC50值

圖4 綠原酸（CA）及維生素C（VC）清除·OH的IC50值

·OH是生物系統(tǒng)中活性最強的自由基，危害性最強[13]。結(jié)果表明青梅花提取物對·OH具有一定程度的清除作用，結(jié)果如圖3所示，以半抑制濃度IC50表示自由基清除能力，其值越小說明清除作用越強。值得注意的是，綠原酸（CA）是青梅花提取物中主要的活性成分[10]，它對·OH自由基清除能力要顯著強于陽性對照VC（見圖4），而VC是已知的清除·OH較強的物質(zhì)之一，說明綠原酸作為青梅花提取物的主要活性成分賦予了PF較強的清除·OH的作用。

2.4 青梅花提取物的還原力

鐵氰化鉀還原法是用來測定樣品鐵還原能力的。結(jié)果表明，所測試樣在該體系中的還原力與樣品濃度呈正相關(guān)。其EC50值越小說明其還原能力越強，如圖5所示，鐵還原能力由強到弱的排序為：CA＞VC＞PF。同上述·OH清除實驗結(jié)果一樣，青梅花提取物中的主要活性成分綠原酸的還原能力要強于陽性對照VC。

圖5 不同物質(zhì)的EC50值（μg/mL）

3 討論

大量的研究結(jié)果表明，多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化作用，而酪氨酸酶所催化的反應正是一系列的氧化還原反應，所以含有多酚類的提取物可以在這個系列反應的多個階段產(chǎn)生抑制作用。許多研究也證實了其具有強的酪氨酸酶抑制作用同時也是具有較強的抗氧化作用[14]。本文的研究也再次證實了這一理論。值得注意的是青梅花提取物的抑制作用又較單一的綠原酸強（p＜0.05），這說明雖然青梅花提取物的這種體外對酪氨酸酶的抑制作用與綠原酸類物質(zhì)的含量密切相關(guān)，但是多種混合的多酚類物質(zhì)較單一的物質(zhì)作用強，這可能是混合物中的不同活性成分對酶的作用位點不同，從而發(fā)生協(xié)同作用，這樣使得抑制作用大大增強。

本研究表明青梅花提取物（PF）對蘑菇酪氨酸酶的抑制是屬于混合型競爭，作用機理可以推斷如下：a.在酪氨酸酶的催化氧化過程中，活性氧既是引發(fā)劑又是反應物，因此PF的這種清除自由基的能力，可以將ROS清除，從而阻斷反應的引發(fā)，使該氧化反應的強度減弱，同時也削弱了酪氨酸酶的供氧作用，所以PF對活性氧的清除作用是其對酪氨酸酶的抑制的一個重要的方面；b.青梅花提取物中的綠原酸類等酚酸類化合物中帶的羧基是強吸電子基，它可以抑制氧化態(tài)的酶中的氧原子與芳環(huán)的取代反應，使氧化態(tài)的酶與這些酚酸類化合物形成的產(chǎn)物成了終端化合物，從而減緩或抑制氧化反應發(fā)生；c.由于青梅花提取物中的多酚類物質(zhì)為含有多個活性酚羥基的結(jié)構(gòu)，而酪氨酸酶催化的反應底物，如酪氨酸、多巴等這些化合物也是含有類似結(jié)構(gòu)，例如對位苯酚的結(jié)構(gòu)，因此在這種多步驟的氧化反應過程中，青梅花提取物中的多酚類化合物可以被酪氨酸酶催化，可以與反應底物競爭性地與酪氨酸酶結(jié)合，從而削弱酪氨酸酶對酪氨酸、多巴等及其系列氧化產(chǎn)物的催化氧化作用；d.實驗已經(jīng)表明，青梅花提取物及其中所含的活性成分綠原酸類具有強的還原效果，如綠原酸類的還原能力較相同濃度的維生素C強（p＜0.05），因為它們這種強的還原能力，可以還原酪氨酸酶催化反應過程中產(chǎn)生的一系列氧化產(chǎn)物（如還原多巴醌），從而阻斷反應發(fā)生或者使反應中間物質(zhì)被還原。

4 結(jié)論

前期研究已經(jīng)表明，綠原酸類物質(zhì)是青梅花提取物（PF）中的主要活性成分，而綠原酸（CA）又具有較強的酪氨酸酶抑制作用。值得注意的是，PF的酪氨酸酶抑制作用比單一的綠原酸（CA）強，這表明PF中除主要的活性成分綠原酸的貢獻外，還存在其他的活性成分發(fā)生協(xié)同作用，這種協(xié)同作用的結(jié)果是使酪氨酸酶的抑制作用大大加強，由此可見，青梅花提取物（PF）是一種十分有前途的酪氨酸酶抑制劑，將來可應用于果蔬等食品的加工和貯藏。

[1]Nwlsin D，Maria A R，Alessandro D A，et al.Applications of laccases and tyrosinases（phenoloxidases）immobilized on different supports[J].Enzyme and Microbial Technology，2002，31：907-931.

[2]Gandia-Herrero F，Jimenez M，Cabanes J，et al.Tyrosinase inhibitory activity of cucumber compounds：enzymes responsible for browning in cucumber[J].Journal of Agricultural Food and Chemistry，2003，51（26）：7764-7769.

[3]陳清西，林建峰，宋康康.酪氨酸酶抑制劑的研究進展[J].廈門大學學報：自然科學版，2007，46（2）：274-282.

[4]石嘉懌，吳曉琴，張英.青梅資源的研究與應用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（6）：106-111.

[5]Singleton V L，Orthofer R，Lamuela-Raventós R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent[J].Methods in Enzymology，1999，299：152-178.

[6]何改.山楂葉黃酮類化合物最佳提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2002，23（1）：15-17.

[7]Huang K F，Chen Y W，Chang C T，et al.Studies on the inhibitoryeffect of Graptopetalum paraguayense E.Walther extracts on mushroom tyrosinase[J].Food Chemistry，2005，89：583-587.

[8]Tian B，Wu Y，Sheng D，et al.Chemiluminescence assay for reactive oxygen species scavenging activities and inhibition on oxidative damage of DNA in Deinococcus radiodurans[J]. Luminescence，2004，19：78-84.

[9]Dorman H J D，Kosar M，Kahlos K，et al.Antioxidant properties and composition of aqueous extracts from Mentha species，hybrids，varieties，and cultivars[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51：4563-4569.

[10]石嘉懌，張英.高效液相色譜法測定青梅花、枝、葉中綠原酸類化合物的種類和含量[J].食品科學，2011，32（2）：191-194.

[11]沈奇，金春雁，張衛(wèi)明，等.蒲公英綠原酸及其包合物對葡萄保鮮作用的研究[J].食品科學，2007，28（6）：332-335.

[12]Lu Y，F(xiàn)oo L Y.Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace [J].Food Chemistry，2002，68：81-85.

[13]Madhava Naidu M，Sulochanamma G，Sampathu S R，et al. Studies on extraction and antioxidant potential of green coffee [J].Food Chemistry，2008，107：377-384.

[14]Chen Q X，Kubo I.Kinetics of mushroom tyrosinase inhibition by quercetin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（14）：4108-4112.

Inhibitory effect and mechanism of Prunus mume flowers extracts on tyrosinase

SHI Jia-yi
（School of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance&Economics,Nanjing 210003,China）

Objective:The inhibitory mechanism of flower extracts from Prunus mume (PF)on tyrosinase was discussed.Method:First，tyrosinase inhibiting activity was determined，and then Lineweaver-Burk curve was made，on which the inhibiting types of PF was deduced.The free radical scavenging and the reducing power of PF were evaluated by chemiluminescence and potassium ferricyanide，respectively.Results:The results showed that PF could inhibit the tyrosinase activity remarkably with the half inhibiting concentration IC50(98.89± 6.34)μg/mL.The type of PF on tyrosinase was mixed inhibition.The effect of PF on tyrosinase might relate to polyphenol，free radicals scavenging ability and reducing power.Conclusion:PF was a promising inhibitor of tyrosinase and could be applied to food processing and storage.

Prunus mume flowers；tyrosinase；free radicals；reducing power

TS255.1

A

1002-0306（2011）10-0205-04

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1，Tyrosinase）廣泛存在于動植物及人體內(nèi)，是結(jié)構(gòu)復雜的多亞基的含銅的氧化還原酶，同時具有單酚酶和二酚酶活性[1]。酪氨酸酶在酶促褐變、體內(nèi)色素合成的過程中起了關(guān)鍵的作用。特別是與果蔬的褐變有著密切關(guān)系，是引起水果、蔬菜發(fā)生酶促褐變的主要酶類。它可使多種果蔬在貯存、處理、加工過程中容易發(fā)生褐變反應，如桃、荔枝、蘋果、馬鈴薯、鱷梨等。同時，酪氨酸酶氧化果蔬中的內(nèi)源性多酚物質(zhì)生成黑色素，影響了果蔬制品的營養(yǎng)、風味及外觀品質(zhì)和商品價值，使產(chǎn)品難以進入市場。目前采用酪氨酸酶抑制劑如半胱氨酸、谷胱甘肽、肉桂酸、VC、天然提取物等處理果蔬，是水果保鮮手段之一[2]。研究表明，酪氨酸酶抑制劑廣泛存在于多種植物中，如柑橘、葡萄、桑葉、蘋果、茶葉等植物的提取物對酪氨酸酶都有抑制作用[3]。由于許多傳統(tǒng)的酪氨酸酶抑制劑大多是化學合成，有一定的毒副作用，因此從植物中分離天然酪氨酸酶抑制劑已得到人們的普遍關(guān)注。青梅（Prunus mume Sieb. Et Zucc）是薔薇科（Rosaceae）櫻桃屬植物。我國是世界上適合栽種青梅地域最廣的國家，目前我國青梅產(chǎn)地分布在全國18個省（自治區(qū)）[4]。據(jù)明代《本草綱目》記載，青梅花具有“開清神思、助雅致”的功效。目前國內(nèi)對青梅花的研究尚屬空白，本文以青梅花提取物為原料，研究了對酪氨酸酶的抑制作用，并通過清除自由基能力、還原能力等方面探討了青梅花提取物對酪氨酸酶的抑制機理，為青梅花在食品、醫(yī)藥及化妝品等工業(yè)的開發(fā)和應用提供理論基礎(chǔ)。

2011-07-15

石嘉懌（1979-），女，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。