鄭淑彥，向進樂,2，李志西,*

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

枳椇醋發(fā)酵階段產(chǎn)物的抗氧化活性變化

鄭淑彥1，向進樂1,2，李志西1,*

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

采用液態(tài)深層發(fā)酵法釀造枳椇醋，以總酚含量、總黃酮含量、清除DPPH自由基能力、還原能力、總抗氧化能力為指標，研究枳椇醋不同發(fā)酵階段產(chǎn)物抗氧化活性的變化。結(jié)果表明：總酚含量和清除DPPH自由基能力在枳椇醋釀造過程中增加；總黃酮含量在酒精發(fā)酵階段減少，在醋酸發(fā)酵階段增加；還原能力發(fā)酵前后相當；總抗氧化能力在酒精發(fā)酵中增強，在醋酸發(fā)酵中略減弱。

枳椇汁；枳椇酒；枳椇醋；抗氧化活性

枳椇(Hovenia dulcis Thunb)為鼠李科拐棗屬(Hovenia Thunb)植物，又名拐棗、萬壽果等。枳椇果梗肥大扭曲，含有豐富的糖類、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。果醋與糧食醋相比具有更為豐富的營養(yǎng)價值，其富含琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、多種氨基酸、維生素及生物活性物質(zhì)[3-4]，且口感醇厚，具有軟化血管、降血壓、消除疲勞、養(yǎng)顏等功效。因此，將個體較小、殘渣較多、適口性較差但營養(yǎng)豐富的枳椇果梗通過發(fā)酵加工成枳椇醋具有較好的現(xiàn)實意義。

水果、葡萄汁、酒、醋中含有酚類物質(zhì)，多酚是一類很有實用前景的天然抗氧化劑及自由基清除劑[5]。流行病學研究證實，一些慢性病和冠心病的發(fā)病率與攝入富含酚類物質(zhì)的食物的多少有關(guān)系[6]。而黃酮類物質(zhì)是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物。黃酮類物質(zhì)在人體內(nèi)可以清除游離自由基，可起到預(yù)防衰老、心血管疾病和癌癥等作用[7]。研究表明，枳椇中含有黃酮類物質(zhì)。據(jù)報道，Yoshikawa等[8]從北枳椇的種子和果實中得到(+)-二氫楊梅黃酮、Hovenitins Ⅰ-Ⅲ，韓國學者從韓國產(chǎn)的北枳椇的果實中得到解酒毒活性成分hovenodulinol[9]。1996年，Liang等[10]從枳椇葉及北枳子中分離得到了黃酮類化合物山奈酚、槲皮素、異槲皮素、蘆丁、(+)-二氫楊梅素等。

目前，關(guān)于枳椇產(chǎn)品抗氧化活性以及發(fā)酵前后抗氧化活性變化的研究較少，因此，本工作研究枳椇發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化，為枳椇這一野生資源的研究開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳椇：產(chǎn)地西安市臨潼區(qū)龍河西岸南姚村。

酵母菌(酒用高活性干酵母) 湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌 上海中科伍佰豪生物有限公司；原兒茶酸、蘆丁、BHA、DPPH 美國Sigma公司；福林酚試劑 上海荔達生物科技有限公司；總抗氧化能力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平 北京塞多利斯天平有限公司；規(guī)格0-30酒精計 上海醫(yī)用儀表廠；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；KDC-40低速離心機科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；TD5A臺式離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枳椇醋發(fā)酵工藝

1.3.1.1 枳椇醋發(fā)酵工藝流程圖

1.3.1.2 枳椇醋發(fā)酵工藝要點

將清理干凈的枳椇果梗加水打漿后(果梗與水質(zhì)量比1:1.5)，加入0.1% 活性酒用干酵母，攪拌均勻，于25℃左右的條件下發(fā)酵，當酒體積分數(shù)達到7%以上且不再上升時，酒精發(fā)酵結(jié)束，離心分離得枳椇酒醪。給枳椇酒醪中接入活化的醋酸菌液(酒醪與菌液體積比10:1)，于33℃左右的條件下，采用實驗室小型自吸式發(fā)酵罐進行通氣發(fā)酵，當酸度達到5%以上且不再上升時，醋酸發(fā)酵結(jié)束。然后采用分割留種法取出1/2 枳椇醋液，經(jīng)過濾、殺菌、澄清得成品枳椇醋。同時給發(fā)酵罐補充枳椇酒醪繼續(xù)進行醋酸發(fā)酵，如此反復(fù)。

1.3.2 總酸的測定

采用酸堿滴定法[11]，總酸含量以醋酸計。

1.3.3 總酚含量的測定

以原兒茶酸為標準品，參考田文禮等[12]的方法進行測定。準確量取0.1mg/mL 原兒茶酸標準液0、0.25、 0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75mL于25mL容量瓶中，各加15mL水，搖勻。再加入1.25mL福林酚試劑，充分搖勻。1min后，加入20g/100mL Na2CO33.75mL，混勻定容，在75℃反應(yīng)10min，冷卻，于波長765nm處測定吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程為：y = 110.24x+ 0.0182(R2=0.998)。

準確吸取0.1mL樣品，按上述方法進行測定，得樣品溶液的吸光度，代入回歸方程計算樣品中總酚的含量。

1.3.4 總黃酮含量的測定

以蘆丁為標準品，參考李利華等[13]的方法進行測定。分別量取0、2、4、6、8、10mL的0.1mg/mL蘆丁標準液于25mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液補到10mL，加入5g/100mL NaNO20.8mL搖勻，放置6min。然后加入10g/100mL Al(NO3)30.8mL搖勻，放置6min，再加入4g/100mL NaOH 10mL搖勻，放置15min，以蒸餾水定容，在波長510nm處測定吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程為：y=12.308x－0.0055(R2=0.9993)。

準確吸取1mL樣品，按上述方法進行測定，得樣品溶液的吸光度，代入回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測定

參考吳瓊英等[14]方法進行測定。將2mL 0.1mmoL/L的DPPH醇溶液加入到2mL含有20、40、 60、80、100μL樣品的水溶液中，混勻反應(yīng)20min后，3500r/min離心10min，取上清液在波長517nm處測定吸光度(Ai)；同時加入2mL DPPH醇溶液和2mL無水乙醇按上述方法測定吸光度(Ac)；以及2mL樣品水溶液和2mL無水乙醇按上述方法測定吸光度(Aj)。根據(jù)下列公式計算清除率。

清除率/%=[1－(Ai－Aj)/Ac]×100

1.3.6 還原能力的測定

參考Oyaizu等[15]方法進行測定。分別將50、100、150、200、250、300μL樣品溶液加入到1mL蒸餾水中，然后加入2.5mL磷酸緩沖液(0.2moL/L pH6.6)混勻，再加入1g/100mL鐵氰化鉀2.5mL。混合物于50℃恒溫20min后，加入1mL 10g/100mL三氯乙酸，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL以及0.1% FeCl30.5mL，在波長700nm處測定吸光度。吸光度越大，說明這種反應(yīng)混合物的還原性越強。

1.3.7 總抗氧化能力的測定

按照總抗氧化能力檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行測定。具體步驟按總抗氧化能力檢測試劑盒操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 枳椇不同發(fā)酵階段產(chǎn)物的總酚、總黃酮含量

按照上述工藝流程制得的枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋來源于同一批原料，分別測定枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋的總酚和總黃酮含量，結(jié)果見表1。

表1 枳椇汁、枳椇酒及枳椇醋中總多酚、總黃酮含量Table 1 Total acid, total phenol and total flavonoid contents in intermediate products at different stages of fermentation of Hovenia dulcis Thunb fruit wine

從表1可以看出，枳椇在發(fā)酵過程中總酚含量增加，總黃酮含量先減少后增加。這可能是因為酵母、醋酸菌等微生物使一些酚類物質(zhì)從枳椇果梗中溶出或是發(fā)酵微生物代謝中產(chǎn)生了這類物質(zhì)從而使總酚含量增加。而在酒精發(fā)酵過程中，黃酮類化合物可能有部分轉(zhuǎn)化為其他酚類物質(zhì)或是其他物質(zhì)，因而總黃酮含量下降[16]。

2.2 清除DPPH自由基的能力

圖1 枳椇發(fā)酵過程中對DPPH自由基清除率的變化Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of intermediate products at different stages of fermentation of Hovenia dulcis Thunb fruit wine at different doses

如圖1所示，100μL的枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋和100μL 100μg/mL的丁基羥基茴香醚(BHA)對DPPH 自由基清除能力分別為55.6%、88.0%、93.8%、51.4%，這表明枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋有明顯的清除DPPH自由基的能力，且三者隨著加入量的增加，清除率基本呈線性增強。三者的大小關(guān)系是：枳椇醋＞枳椇酒＞枳椇汁。這表明在酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵這兩個過程中，清除DPPH自由基能力逐漸增強，這可能是由于在發(fā)酵階段多酚含量增大引起清除DPPH自由基的能力增強。這一變化趨勢和閆霞等[16]對山西老陳醋抗氧化物質(zhì)的研究結(jié)果一致。

2.3 還原能力

如圖2所示，枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋都具有較強的還原能力，隨著用量的增加，還原能力增強。枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋三者的還原能力幾乎相當，枳椇醋略強于枳椇酒，枳椇酒略強于枳椇汁。這表明，枳椇在酒精發(fā)酵過程和醋酸發(fā)酵過程中還原能力略微增強。枳椇汁還原力較強可能是因為其中含有較多的還原糖及抗氧化成分如VC。據(jù)報道，每100g枳椇果梗中約含總糖31.3g，還原糖20.3g；枳椇果梗中VC的含量約為202mg，明顯比蘋果[17]等水果中的VC含量高。這些維生素可能和多酚類物質(zhì)有協(xié)同作用使得枳椇汁的還原能力增強[18]。楚文靖等[19]研究了紫甘薯酒和汁的抗氧化性，其結(jié)果和本實驗一致。

圖2 枳椇發(fā)酵過程中還原能力的變化Fig.2 Reducing power of intermediate products at different stages of fermentation of Hovenia dulcis Thunb fruit wine at different doses

2.4 總抗氧化能力

圖3 枳椇發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化Fig.3 Total antioxidant capacities of intermediate products at different stages of fermentation of Hovenia dulcis Thunb fruit wine at different doses

如圖3所示，當加入量為100μL時，枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋、100μg/mL BHA 的總抗氧化能力分別為36.0、53.5、45.9mg/mL和7.7mg/mL。枳椇酒的總抗氧化能力要高于枳椇醋，枳椇醋高于枳椇汁。這表明，在發(fā)酵過程中，總抗氧化能力先增強后減弱。這可能是因為醋酸發(fā)酵使得酒中含有高抗氧化活性的酚類物質(zhì)減少或是醋中產(chǎn)生一些新的低抗氧化活性的酚類成分，雖然醋中總酚含量高于酒中總酚含量，但是決定抗氧化活性高低的有效成分在醋中的比例減少，因而總抗氧化能力呈現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象[20]。

3 結(jié) 論

通過研究枳椇發(fā)酵階段產(chǎn)物體外抗氧化活性，得出結(jié)論如下：枳椇汁在酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過程中抗氧化能力增強。同時，這一變化和總酚含量變化趨勢一致，這表明，枳椇在發(fā)酵過程中多酚含量的變化對抗氧化能力的變化起了作用。枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋都具有較強的清除DPPH自由基的能力、還原能力以及總抗氧化能力，是較好的天然抗氧化劑。

本研究只取了發(fā)酵過程的3個產(chǎn)物來預(yù)測枳椇發(fā)酵過程的抗氧化能力的變化，其他產(chǎn)物有待于今后進一步更深入的研究。

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Changes in Antioxidant Properties of Hovenia dulcis Thunb Vinegar during Fermentation Process

ZHENG Shu-yan1，XIANG Jin-le1,2，LI Zhi-xi1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Liquid-state submerged fermentation was employed to brew Hovenia dulcis Thunb fruit wine, and the antioxidant properties of intermediate products at different fermentation stages were comparatively evaluated based on DPPH free radical scavenging ability, reducing power and total antioxidant capacity. The results indicated that all DPPH free radical scavenging ability, reducing power and total antioxidant capacity displayed an upward trend during the fermentation. Total flavonoid content revealed a trend to decline in the alcohol fermentation stage and to ascend in the acetic acid fermentation stage. Almost no difference in reducing power before and after fermentation was observed. Total antioxidant capacity was elevated in the alcohol fermentation and slightly attenuated in the acetic acid fermentation.

Hovenia dulcis Thunb fruit juice；Hovenia dulcis Thunb fruit wine；Hovenia dulcis Thunb fruit vinegar；antioxidant activity

TS255.47

A

1002-6630(2011)07-0113-04

2010-09-10

鄭淑彥(1983—)，女，碩士研究生，主要從事發(fā)酵食品研究。E-mail：zsy_8323@163.com

*通信作者：李志西(1958—)，男，教授，博士，主要從事谷物功能食品及發(fā)酵食品研究。

E-mail：lzx580721@yahoo.com.cn