陸 娟，肖 敏*，盧麗麗

(1.山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室，國家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250100；2.阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽 236041)

地衣芽孢桿菌產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

陸 娟1,2，肖 敏1,*，盧麗麗1

(1.山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室，國家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250100；2.阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽 236041)

通過單因素試驗(培養(yǎng)基用水、碳源、氮源、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH值)和正交試驗對地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)8-37-0-1發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。結(jié)果表明：以蔗糖100g/L、牛肉膏1.0g/L、酵母粉0.6g/L、K2HPO4 3.0g/L、KH2PO4 3.0g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 0.001g/L，自來水配制，培養(yǎng)基初始pH5.0，30℃培養(yǎng)8-37-0-1菌株24h，Levan果聚糖產(chǎn)量達到最高值41.7g/L，約是未優(yōu)化時的5.0倍。

Bacillus licheniformis8-37-0-1；Levan；發(fā)酵條件；優(yōu)化

Levan果聚糖是一類分子中含有大量β-(2,6)糖苷鍵和少量β-(2,1)果糖苷鍵的多糖，與分子中主要含有β-(2,1)果糖苷鍵的菊粉類果聚糖顯著不同[1]。Levan果聚糖的分子質(zhì)量通常在幾萬到一兩百萬之間，在食品工業(yè)方面，它可作為功能性食品的重要組成部分[2]、低聚果糖生產(chǎn)的原材料以及乳化劑和成膜劑等[3]。在醫(yī)藥方面，Levan果聚糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)控、抗感染等作用，還可以作為血漿的替代品[3-5]。除此以外，由于具有與透明質(zhì)酸一樣的保濕效果及對人體纖維原細胞和角化細胞相似的增殖作用，Levan果聚糖還可作為化妝品添加劑使用[6]。Levan果聚糖廣泛的應(yīng)用潛力使其生產(chǎn)得到了人們的關(guān)注。

L e v a n果聚糖可來源于植物或微生物，小麥(Triticum aestivum)[7]、黑麥草(ryegrass)和鴨茅(cocksfoot)[8]等植物可以產(chǎn)生低分子質(zhì)量的Levan果聚糖，高分子質(zhì)量的Levan果聚糖主要由微生物發(fā)酵產(chǎn)生。Levan果聚糖的產(chǎn)生菌多為細菌，早在1902年，Smith從桃金娘科的植物屬(Eucalyptus stuartina)的含糖分泌物中就發(fā)現(xiàn)了可以產(chǎn)Levan果聚糖的微生物，隨后發(fā)現(xiàn)木醋桿菌(Acetobacter xylinum)[9]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[10]、產(chǎn)果聚糖微桿菌(Microbacterium laevaniformans)[11]、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)[12]、運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)[3,13-14]、舊金山乳桿菌(Lactobacillus sanfranciscensis)[15-16]和腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)[4,17-18]等細菌都可以產(chǎn)生Levan果聚糖，其產(chǎn)量約在14.4～36g/L之間。目前，國內(nèi)外尚未見利用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發(fā)酵產(chǎn)生Levan多糖的報道。本研究對地衣芽孢桿菌8-37-0-1產(chǎn)生Levan果聚糖的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期能大幅度提高該菌株Levan果聚糖的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)8-37-0-1為本實驗室篩選獲得，前期工作中已鑒定該菌產(chǎn)生的多糖為Levan 果聚糖[19]。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏1.0、(NH4)2SO40.5、K2HPO42.5、KH2PO42.5、NaCl 1.0、蔗糖30、MgSO4·7H2O 0.2、FeSO4·7H2O 0.001，水 1000mL，pH7.0。115℃滅菌 30min。

菌種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基180r/min、30℃搖床培養(yǎng)16h活化后，按體積分數(shù)4%的接種量擴大培養(yǎng)60h。1.3 儀器與設(shè)備

LC-10A高效液相色譜(配置RID-10A示差檢測器)日本島津公司；Aminex HPX-42C糖分析柱 (300mm×7.8mm) 美國Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 多糖的測定

取發(fā)酵液于12000r/min、4℃離心10min，取上清液，加入3倍體積的冷異丙醇，4℃靜置過夜，離心棄上清液，沉淀加入少量蒸餾水溶解后定容于100mL容量瓶中，苯酚-硫酸法測Levan果聚糖[20]，以葡萄糖為標準繪制標準曲線。

1.4.2 蔗糖及單糖測定

采用高壓液相色譜法(HPLC)法測定蔗糖及單糖的含量。發(fā)酵上清液稀釋成5g/100mL溶液，用0.2μm濾膜過濾后進樣，進樣量為10μL。流動相為超純水，流速為0.4mL/min，柱溫70℃。分析軟件為Class-VP 6.0。

1.4.3 菌體生物量測定

取發(fā)酵液適量，采用分光光度法測定OD600nm值。

1.4.4 單因素試驗

依次改變發(fā)酵培養(yǎng)基水質(zhì)、碳源、氮源以及培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值，接種8-37-0-1菌株進行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)，測定生物量和Levan果聚糖產(chǎn)量。

1.4.5 正交試驗

表1 正交試驗因素水平設(shè)計表Table 1 Factors and their levels in orthogonal array design

選取蔗糖、酵母粉和磷酸鹽3個因素，采用4因素3水平的正交表(L9(34))設(shè)計試驗，優(yōu)化條件的因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 自來水和蒸餾水對8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

分別用蒸餾水和自來水配制發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵產(chǎn)多糖實驗。結(jié)果表明：用自來水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基Levan果聚糖產(chǎn)量為9.02g/L，稍高于蒸餾水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)量8.40g/L，所以在后面的實驗中都用自來水配制發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件對8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

圖1 培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件對Levan果聚糖產(chǎn)量和生物量的影響Fig.1 Single factor investigation of the effects of medium and fermentation conditions on levan production and Bacillus licheniformis 8-37-0-1 biomass

2.2.1 碳源對8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

分別以30g/L的蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖為唯一碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接種進行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。從圖1A可以看出，以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中多糖最多，蔗糖培養(yǎng)基多糖量次之，為8.86g/L。但考慮到淀粉及其不完全分解產(chǎn)物會影響發(fā)酵液中Levan果聚糖產(chǎn)量的測定，并且將會影響Levan果聚糖的后提取，故選用蔗糖為碳源進一步開展研究。

2.2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

分別接種含有不同質(zhì)量濃度蔗糖(10、30、50、70、90g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)，圖1B結(jié)果顯示，當蔗糖質(zhì)量濃度在10～90g/L范圍內(nèi)時Levan果聚糖產(chǎn)量隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大而增大，在蔗糖質(zhì)量濃度90g/L時Levan果聚糖產(chǎn)量達到23.45g/L。

2.2.3 氮源對8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中，蔗糖為90g/L，牛肉膏含量不變，硫酸銨用同樣質(zhì)量濃度(0.5g/L)的酵母粉、蛋白胨、尿素、氯化銨、硝酸銨替換配制發(fā)酵培養(yǎng)基，進行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)，圖1C結(jié)果表明，同樣比例的有機氮替換硫酸銨比無機氮替換更有利于菌體生長，其中酵母粉替換的培養(yǎng)基，Levan果聚糖產(chǎn)量達到最高，為30.78g/L。

2.2.4 酵母粉質(zhì)量濃度對8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

進一步接種用不同質(zhì)量濃度酵母粉(0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0g/L)替換0.5g/L硫酸銨、90g/L蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。圖1D結(jié)果顯示：隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加，菌體生物量不斷增加，但多糖產(chǎn)量卻在減少，故選用酵母粉質(zhì)量濃度為0.5g/L，此時Levan果聚糖產(chǎn)量為30.54g/L。

2.2.5 培養(yǎng)溫度對8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

以上的實驗均是在30℃條件下進行的。為了進一步研究培養(yǎng)溫度對產(chǎn)多糖量的影響，接種發(fā)酵培養(yǎng)基(90g/L蔗糖、0.5g/L酵母粉替換0.5g/L硫酸銨)后，分別在20、25、30、37℃條件下進行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。圖1E結(jié)果表明，20℃菌體生物量較低，25～37℃菌體生物量變化不大，30℃多糖產(chǎn)量最高(30.92g/L)。

2.2.6 培養(yǎng)基初始pH值對8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

分別接種初始pH值分別為4、5、6、7、8、9的發(fā)酵培養(yǎng)基(90g/L蔗糖、0.5g/L酵母粉替換0.5g/L硫酸銨)進行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)，結(jié)果見圖1F。隨著pH值的升高，菌體生物量不斷升高，但并不利于多糖的產(chǎn)生，pH5.0時Levan果聚糖產(chǎn)量達到最高，為31.29g/L。

2.3 正交試驗

蔗糖和酵母粉對Levan果聚糖產(chǎn)量的影響較大(圖1)，而磷酸鹽在菌體的生長和多糖的生物合成中起著非常重要的作用[21]，故選取蔗糖、酵母粉和磷酸鹽3個因素進行設(shè)計正交試驗，培養(yǎng)基的其他組分同發(fā)酵培養(yǎng)基，pH5.0、30℃培養(yǎng)60h。正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design layout and experimental results

從表2可知，對Levan果聚糖產(chǎn)量培養(yǎng)基組分的影響因子依次排序為A＞C＞B，即蔗糖＞總磷酸鹽＞酵母粉。正交設(shè)計助手Ⅱ v3.1分析得出的方差分析結(jié)果顯示：蔗糖和總磷酸鹽的質(zhì)量濃度對Levan果聚糖產(chǎn)量的影響起最主要作用，酵母粉質(zhì)量濃度在此試驗范圍內(nèi)的影響最小(表3)。綜合考慮各因素對多糖產(chǎn)量的影響，得出最優(yōu)的組合為A3C3B3，即蔗糖100g/L、總磷酸鹽6.0g/L(磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀各為3.0g/L)、酵母粉0.6g/L。選用最優(yōu)組合，培養(yǎng)基的其他組分同發(fā)酵培養(yǎng)基，pH5.0、30℃培養(yǎng)60h，多糖產(chǎn)量為42.41g/L，顯著高于正交試驗的其他組合。

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Variance analysis for the results from orthogonal array design

2.4 8-37-0-1菌株發(fā)酵產(chǎn)糖時間曲線

圖2 8-37-0-1菌株Levan果聚糖的發(fā)酵時間曲線Fig.2 Time course of growth and levan fermentation from Bacillus licheniformis 8-37-0-1

在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下測定地衣芽孢桿菌8-37-0-1發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的發(fā)酵時間曲線，即蔗糖100g/L、磷酸氫二鉀3.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、酵母粉0.6g/L替換硫酸銨，其他成分同發(fā)酵培養(yǎng)基，pH5.0，30℃培養(yǎng)。分別在不同的時間取樣，測定發(fā)酵液中Levan果聚糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量，以及菌體生物量、pH值的變化情況，結(jié)果見圖2。在0～24h內(nèi)蔗糖消耗速度最快，培養(yǎng)至52h時蔗糖幾乎全部消耗；而Levan果聚糖含量在24h時達到最高，為41.7g/L，隨后呈緩慢下降趨勢；在48h時葡萄糖和果糖量都達到最高值，并且葡萄糖顯著高于果糖，48h后約是果糖的4倍多，隨后都進入穩(wěn)定期；菌體在16h時就進入了穩(wěn)定期，28h進入衰亡期；在整個發(fā)酵過程中pH值變化不大，波動于4.5～4.7之間。

3 討 論

本實驗對一株產(chǎn)Levan果聚糖的芽孢桿菌B. licheniformis8-37-0-1的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：用自來水配制的培養(yǎng)基比用蒸餾水配制的培養(yǎng)基產(chǎn)糖多，這與斯達油脂酵母U9018產(chǎn)胞外多糖[22]的發(fā)酵條件一致，可能是自來水中含有一定的各種離子促進Levan果聚糖的合成。在以非多糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的實驗中蔗糖是最優(yōu)的碳源，這與運動發(fā)酵單胞菌、木醋桿菌等發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的情況一致[3,9]。酵母粉質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果表明，酵母粉質(zhì)量濃度的增加有利于菌體生長，但不利于Levan果聚糖的產(chǎn)生。蔗糖質(zhì)量濃度的優(yōu)化和酵母粉質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果都證明了高碳氮比例有利于胞外多糖的產(chǎn)生[21]，本研究得到的碳氮比例是125:2。微生物不同其Levan產(chǎn)量也不盡相同。多黏芽孢桿菌NRRL-18475接種150g/L蔗糖培養(yǎng)基，30℃、170r/min搖床培養(yǎng)10d，Levan產(chǎn)量為36g/L[12]。運動發(fā)酵單胞菌ATCC 31821接種250g/L蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)24h，Levan產(chǎn)量為21.685g/L[3]。運動發(fā)酵單胞菌B4286變體ZML1和ZML2接種150g/L蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，Levan產(chǎn)量分別為21.6、20.0g/L[13]。芽孢桿菌以12g/100mL蔗糖為碳源，其Levan果聚糖產(chǎn)量為28.2g/L[23]。而本研究中，地衣芽孢桿菌8-37-0-1接種100g/L蔗糖、3.0g/L磷酸氫二鉀、3.0g/L磷酸二氫鉀、0.6g/L酵母粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h時，Levan果聚糖產(chǎn)量高達41.7g/L，大約是優(yōu)化前的5.0倍，顯著高于其他菌株的Levan產(chǎn)量。本研究通過發(fā)酵條件的優(yōu)化顯著提高了地衣芽孢桿菌8-37-0-1的Levan果聚糖產(chǎn)量，為該菌株的工業(yè)開發(fā)提供參考。

[1] MONSAN P, BOZONNET S, ALBENNE C, et al. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(9):675-685.

[2] BEKERS M, LAUKEVICS J, UPITE D, et al. Fructooligosaccharide and levan producing activity ofZymomonas mobilisextracellular levansucrase M[J]. Process Biochemistry, 2002, 38(5): 701-706.

[3] de OLIVEIRA M R, da SILVA R S S F, BUZATO J B, et al. Study of levan production byZymomonas mobilisusing regional low-cost carbohydrate sources[J]. Biochemical Engineering Journal, 2007, 37(2): 177-183.

[4] KANG H K, SEO M Y, SEO E S, et al. Cloning and expression of levansucrase fromLeuconostoc mesenteroidesB-512 FMC inEscherichia coli[J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 1727(1): 5-15.

[5] RAIRAKHWADA D, PAL A K, BHATHENA Z P, et al. Dietary microbial levan enhances cellular non-specific immunity and survival of common carp (Cyprinus carpio) juveniles[J]. Fish & Shellfish Immunology,2007, 22(5): 477-486.

[6] KIM K H, CHUNQ C B, KIM Y H, et al. Cosmeceutical properties of levan produced byZymomonas mobilis[J]. International Journal of Cosmetic Science, 2005, 56(6): 395-406.

[7] PRAZNIK W, SPIES T, HOFINGER A. Fructooligosaccharides from the stem ofTriticum aestivum[J]. Carbohydrate Research, 1992, 235(1/2): 231-238.

[8] FEINGOLD D S, GEHATIA M. The structure and property of levan, a polymer ofD-fructose produced by cultures and cell-free extracts ofAerobacter levanicum[J]. Journal of Polymer Science, 1957, 23(104):783-790.

[9] TAJIMA K, UENISHI N, FUJIWARA M, et al. The production of a new water-soluble polysaccharide byAcetobacter xylinumNCI 1005 and its structural analysis by NMR spectroscopy[J]. Carbohydrate Research,1998, 305(1): 117-122.

[10] MENG Guoyu, FTTERER K. Donor substrate recognition in the raffinose-bound E342A mutant of fructosyltransferaseBacillus subtilislevansucrase[J]. BMC Structural Biology, 2008, 8: 16. doi:10.1186/1472-6807-8-16. doi: 10. 1186/1472-6807-8-16.

[11] BAE I Y, OH I K, LEE S, et al. Rheological characterization of levan polysaccharides fromMicrobacterium laevaniformans[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2008, 42(1): 10-13.

[12] HAN Y W, WATSON M A. Production of microbial levan from sucrose,sugarcane juice and beet molasses[J]. Journal of Industrial Microbiology,1992, 9(3/4): 257-260

[13] KRISHNAN ANANTHALAKSHMY V, GUNASEKARAN P. Isolation and characterization of mutants from levan-producingZymomonas mobilis[J]. Journal of Bioscience Bioengineering, 1999, 87(2): 214-217.

[14] CHIANG C J, WANG J Y, CHEN P T, et al. Enhanced levan production using chitin-binding domain fused levansucrase immobilized on chitin beads[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 82(3):445-451.

[15] TIEKING M, EHRMANN M A, VOGEL R F, et al. Molecular and functional characterization of a levansucrase from sourdough isolateLactobacillus sanfranciscensisTMW 1.392[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 66(3): 655-663.

[16] KADITZKY S, SEITTER M, HERTEL C, et al. Performance ofLactobacillus sanfranciscensisTMW 1.392 and its levansucrase deletion mutant in wheat dough and comparison of their impact on bread quality[J]. Europe Food Research Technology, 2008, 227(2): 433-442.

[17] OLVERA C, CENTENO-LEIJA S, LOPEZ-MUNGUIA A. Structural and functional features of fructansucrases present inLeuconostoc mesenteroidesATCC 8293[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2007, 92(1):11-20.

[18] MORALES-ARRIETA S, RODRIGUEZ M E, SEGOVIA L. Identification and functional characterization oflevS, a gene encoding for a levansucrase fromLeuconostoc mesenteroidesNRRL B-512 F[J]. Gene,2006, 376(1): 59-67.

[19] LIU Chunhui, LU Juan, LU Lili, et al. Isolation, structural characterization and immunological activity of an exopolysaccharide produced byBacillus licheniformis8-37-0-1[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(14): 5528-5533.

[20] DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry,1956, 28(3): 350-356.

[21] IAN W, SUTHERLAND. Microbial polysaccharides from Gram-negative bacteria[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(9): 663-674.

[22] 劉月英, 薛雄志, 鄭忠輝. 斯達油脂酵母U9018產(chǎn)胞外多糖的適宜條件[J]. 微生物學(xué)通報, 1996, 23(5): 268-271.

[23] ELISASHIVILI V I. Levan synthesis by aBacillussp. culture[J]. Prikl Biokhim Microbiology, 1984, 20(1): 101-106.

Optimization of Fermentation Conditions for Production of Levan byBacillus licheniformis8-37-0-1

LU Juan1,2，XIAO Min1,*，LU Li-li1
(1. State Key Laboratory of Microbial Technology and National Glycoengineering Research Center, Shandong University,Jinan 250100, China；2. School of Life Sciences, Fuyang Teachers College, Fuyang 236041, China)

The medium and fermentation conditions for levan production byBacillus licheniformis8-37-0-1 were optimized by single factor and orthogonal array experiments. After culture at 30 ℃ for 24 h in a medium prepared with tap water consisting of sucrose 100 g/L, yeast extract 0.6 g/L, beef extract 1.0 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, K2HPO4 3.0 g/L, NaCl 1.0 g/L, MgSO4·7H2O 0.2 g/L and FeSO4·7H2O 0.001 g/L, a maximum levan production of 41.7 g/L was achieved, which was 5.0 times higher than before optimization.

Bacillus licheniformis8-37-0-1；levan；fermentation condition；optimization

TQ920.1

A

1002-6630(2011)07-0183-05

2010-07-11

國家自然科學(xué)基金項目(31070064)；山東大學(xué)自主創(chuàng)新基金項目(2009DX002)

陸娟(1979—)，女，碩士，主要從事微生物多糖研究。E-mail：lujuan918@sohu.com

*通信作者：肖敏(1962—)，女，教授，博士，主要從事微生物技術(shù)研究。E-mail：minxiao@sdu.edu.cn