馬亞琴，葉興乾，吳厚玖，王 華，孫志高

(1. 西南大學(xué)柑桔研究所，國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712；2. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

超聲處理對(duì)琯溪蜜柚果皮中酚酸含量及抗氧化性的影響

馬亞琴1，葉興乾2，吳厚玖1，王 華1，孫志高1

(1. 西南大學(xué)柑桔研究所，國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712；2. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

應(yīng)用超聲波強(qiáng)化提取琯溪蜜柚果皮中的酚酸組分，探討超聲因素(超聲時(shí)間、溫度、超聲能量)對(duì)酚酸含量及抗氧化性的影響。利用高效液相色譜檢測(cè)琯溪蜜柚果皮中的7種酚酸含量；分別采用福林酚法及鐵離子還原力法(FRAP法)對(duì)超聲提取物的抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：琯溪蜜柚果皮中芥子酸含量最高，7種酚酸含量均隨超聲時(shí)間和溫度的增加而增加，但是在40℃超聲處理60min后造成酚酸含量的顯著降低，同樣超聲功率對(duì)酚酸含量也有積極的影響。此外，超聲時(shí)間、溫度及超聲功率對(duì)總酚含量也呈現(xiàn)出顯著的影響。超聲處理后，總酚與抗氧化能力(TEAC值)有良好的線性關(guān)系，在30、40℃的提取溫度(分別處理10、20、30、45、60min)和4個(gè)超聲功率(3.2、8、30、56W)水平下，R2依次為0.8832、0.8874、0.9397，表明琯溪蜜柚皮中提取物的抗氧化性可能與總酚有關(guān)，超聲處理可以顯著提高琯溪蜜柚果皮提取物的抗氧化能力。

超聲處理；琯溪蜜柚皮；酚酸；抗氧化能力

酚類物質(zhì)是植物在正常生長(zhǎng)期間以及在應(yīng)激一些脅迫條件如感染、創(chuàng)傷及紫外輻射時(shí)所產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物[1]。在植物界酚類物質(zhì)是微量營(yíng)養(yǎng)元素的主要組成成分之一，也是人類和動(dòng)物飲食的重要組成部分，廣泛存在于水果和蔬菜中(如葡萄、柑橘、蘋果、草莓、蔥以及茶飲料和紅酒等)[2-4]。植物界酚類物質(zhì)是由8000多種不同的成分構(gòu)成，具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性以及抗氧化性的一類衍生物，其中酚酸表現(xiàn)出良好的抗氧化性和清除自由基的能力。最近的研究發(fā)現(xiàn)酚酸具有抗炎癥、抗氧化、抗突變、抗心血管疾病等多種藥理性作用，因而與人類的健康密不可分。

人體中的酚酸主要是通過(guò)日常飲食來(lái)攝取。近年來(lái)，酚酸類物質(zhì)作為天然抗氧化劑和食品添加劑在食品工業(yè)領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注。柑橘是膳食酚酸的良好來(lái)源，在食品工業(yè)中柑橘主要用于榨汁和生產(chǎn)柑橘類的飲料，這必將產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，約占柑橘總質(zhì)量的50%左右，而柑橘皮中的酚酸含量均高于柑橘水果的其他部位[5]。柑橘水果中大部分酚酸以不溶性聚合物的結(jié)合態(tài)形式存在，因此，選擇有效的提取方法從橘皮中分離酚酸是非常必要的。已有不少學(xué)者研究了處理方法對(duì)提取柑橘水果中的酚酸及增強(qiáng)其抗氧化性的影響，例如，溶劑提取[6]、酶輔助提取[7]、γ-射線輔助提取[8]、熱處理[9-10]等。

最近，超聲輔助提取技術(shù)由于其快速、高效、節(jié)能和環(huán)保的特點(diǎn)已被廣泛的應(yīng)用于提取各種植物活性成分的研究。以前的研究[11-12]報(bào)道了超聲輔助提取對(duì)溫州蜜柑皮提取物中的酚酸及抗氧化能力的影響，認(rèn)為超聲處理對(duì)提高其酚酸含量和增強(qiáng)抗氧化能力表現(xiàn)出很大的潛力。但是，超聲波處理對(duì)琯溪蜜柚果皮抗氧化性的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用100kHz超聲波研究超聲時(shí)間、溫度、超聲能量對(duì)琯溪蜜柚果皮中酚酸及抗氧化性的影響，并分析酚酸與抗氧化能力的相關(guān)性，旨在挖掘琯溪蜜柚果皮的深加工價(jià)值，以期為開發(fā)柑橘皮副產(chǎn)物的有效加工技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

琯溪蜜柚 市售。

新鮮的琯溪蜜柚手工剝皮，琯溪蜜柚皮放置在光線好、通風(fēng)、干燥的環(huán)境失水，然后將其置于50℃條件下恒溫干燥。烘干的柑橘皮用小型的粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩得到粒徑為0.45～1mm的干樣粉末。

咖啡酸(caffeic acid)、對(duì)香豆酸(p-coumaric acid)、阿魏酸(ferulic acid)、芥子酸(sinapic acid)、原兒茶酸(protocatechuic acid)、對(duì)羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)、香草酸(vanillic acid) 美國(guó)Sigma公司；福林酚試劑 杭州鼎國(guó)試劑公司；高效液相采用色譜級(jí)甲醇和超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

溫控、可調(diào)功率、數(shù)字化時(shí)間超聲波 廣州辛諾科超聲設(shè)備有限公司；Waters2695-2996高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀-52AA 北京順杰欣隆科技有限公司。

1.3 超聲提取

準(zhǔn)確稱取2g橘皮粉，置入600mL的燒杯，加入40mL 80%的甲醇進(jìn)行超聲提取。超聲條件分別設(shè)定為：在功率8W、溫度為30℃和40℃的條件下分別超聲處理10、20、30、45、60min；在溫度為30℃超聲時(shí)間為10min的條件下研究超聲功率3.2、8、30、56W。濾紙過(guò)濾超聲提取液，濾液放置在－20℃冰箱以備高效液相測(cè)定。

1.4 酚酸的提取

酚酸提取方法參照文獻(xiàn)[13-14]，并有所改進(jìn)。準(zhǔn)確移取20mL濾液，在 40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)醇，用15mL 4mol/L氫氧化鈉溶液暗室水解4h，然后用4mol/L鹽酸調(diào)pH值至1～2。再用乙酸乙酯與乙醚體積比1:1提取3次(與提取液體積比1:1)，合并萃取液，35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，溶于10mL甲醇。每份樣品3個(gè)重復(fù)，測(cè)定結(jié)果取平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 HPLC測(cè)定

色譜條件：色譜柱為迪馬C18反相色譜柱(250mm×4.6mm)，用高效液相測(cè)定酚酸。柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20μL，流速1mL/min，流動(dòng)相為 4%乙酸-甲醇體積比為20:80。以標(biāo)樣的保留時(shí)間與紫外-可見光圖譜確定樣品酚酸組成?？Х人?、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸于320nm波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積，原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸260nm波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積，外標(biāo)法定量，如圖1所示。

圖1 酚酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of phenolic acid standards

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別準(zhǔn)確稱取7種酚酸的標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用甲醇溶解并定容至10mL的容量瓶。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配制標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

橘皮中酚酸的測(cè)定 將1.4節(jié)的酚酸提取液進(jìn)樣前過(guò)0.22μm濾膜。

1.6 總酚含量測(cè)定

采用改進(jìn)后的福林酚法[15]測(cè)定柑橘皮提取物中的總酚含量。準(zhǔn)確移0.25mL的甲醇提取液于25mL的容量瓶，加入蒸餾水至總體積為10mL，加0.5mL福林酚試劑振蕩混合均勻，5min后加入5mL、6g/100mL的Na2CO3溶液，然后用蒸餾水定容至25mL，充分振蕩后靜置30min，在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。沒食子酸做標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量以每克干樣所含毫克當(dāng)量沒食子酸來(lái)表示。

1.7 抗氧化能力測(cè)定

采用FRAP法來(lái)測(cè)定柑橘皮提取物的抗氧化能力。原液包括200mmol/L的醋酸緩沖液(pH 3.6)，10mmol/L TPTZ(溶于40mmol/L 的HCl)，20mmol/L的氯化亞鐵溶液，將上述3種溶液按體積比10:1:1的比例來(lái)配制FRAP試劑。100μL的超聲提取液與4900μL的FRAP試劑在暗室中充分反應(yīng)30min后，采用島津2550紫外分光光度計(jì)在593nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用Trolox溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗氧化能力以每克干樣當(dāng)量的Trolox(TEAC)的量來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取對(duì)琯溪蜜柚果皮中酚酸含量的影響

柑橘水果中酚酸大部分以結(jié)合態(tài)的形式存在。因此，本實(shí)驗(yàn)主要分析超聲處理對(duì)酸解后7種游離酚酸(咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸)的影響。用高效液相色譜測(cè)定酚酸含量，并評(píng)價(jià)了超聲因素對(duì)總酚及抗氧化性的影響。

由表1可知，所測(cè)定的7種酚酸組分中，芥子酸含量最高，其次是香草酸，含量最低的是原阿茶酸。超聲處理對(duì)7種酚酸含量有顯著的影響，酚酸含量隨著超聲時(shí)間和溫度的增加而增加。在其他條件不變的情況下，溫度的增加可以有效地增加酚酸含量，當(dāng)溫度從30℃增加到40℃，超聲處理30min，咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸分別增加了23.36%、38.18%、23.79%、4.85%、15.96%、3.76%、14.82%；在30℃的溫度下，超聲時(shí)間從10min增加到30min其提取量呈增加趨勢(shì)，其中咖啡酸、芥子酸含量增幅最大，分別增加了13.14%、15.24%，但原兒茶酸和香草酸的含量有不同程度的下降，之后延長(zhǎng)超聲時(shí)間其提取量變化不明顯。在40℃、超聲處理30min酚酸含量總體達(dá)到最大，但超聲處理60min后，造成7種酚酸含量的顯著下降，其中咖啡酸、對(duì)香豆酸含量降幅最大，分別下降了33.39%、46.14%。因此，隨著提取溫度的升高和超聲時(shí)間的不斷延長(zhǎng)酚酸含量表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，且超聲溫度較超聲時(shí)間對(duì)酚酸含量的影響更為顯著。以前的研究表明超聲強(qiáng)化提取溫州蜜柑皮中的酚酸，40℃易造成酚酸的降解[11-12]。同樣，高溫?zé)崽幚砀涕倨ず?，造成其酚酸的含量大幅度下降[9-10]。這說(shuō)明酚類物質(zhì)是一類不穩(wěn)定的活性物質(zhì)，特別是在超聲波強(qiáng)化提取酚酸時(shí)需慎重選擇提取溫度，一方面，空穴作用產(chǎn)生局部的高溫高壓易造成熱不穩(wěn)定的酚酸發(fā)生降解；另一方面，高溫不利于空穴氣泡的產(chǎn)生，從而消弱空穴作用。因此，應(yīng)用超聲輔助提取酚酸類物質(zhì)時(shí)選擇合適的溫度是非常重要的。在本研究條件下，認(rèn)為超聲輔助提取柑橘皮中酚酸的最佳溫度為30℃。

由表2可知，隨著超聲功率的增加酚酸含量呈顯著增加趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率從3.2W增加到56W時(shí)，咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸分別增加了20.92%、19.60%、21.50%、11.86%、14.58%、11.09%，但原兒茶酸的含量卻下降了12.69%。從欖仁樹果實(shí)中超聲強(qiáng)化提取單寧酸[16]，超聲功率從20W增加到100W時(shí)，單寧酸含量增加了3～5倍，這表明超聲功率是一個(gè)重要的超聲參數(shù)。

因此，增加超聲功率對(duì)提高酚酸含量有一定的積極作用。但提取溫度、超聲時(shí)間的變化對(duì)單個(gè)酚酸的影響趨勢(shì)是不同的，表明超聲輔助提取植物活性成分，其提取效率可能與提取物的理化性質(zhì)有關(guān)。Paniwnyk等[17]從槐樹花芽中超聲增強(qiáng)提取蘆丁，發(fā)現(xiàn)不當(dāng)?shù)某曁幚韺?dǎo)致提取量的下降。因此，利用超聲輔助提取多種不穩(wěn)定活性物質(zhì)時(shí)，其超聲條件應(yīng)根據(jù)提取物的理化性質(zhì)來(lái)設(shè)計(jì)。

表1 超聲時(shí)間和溫度對(duì)琯溪蜜柚皮中酚酸含量的影響Table 1 Effect of ultrasonic treatment time and temperature on the content of total phenolic acids in extracts from Guanxi pomelo peels

從能耗的角度綜合考慮，確定在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，超聲提取琯溪蜜柚皮中酚酸的最佳提取條件為超聲時(shí)間30min、提取溫度30℃、超聲功率56W。

2.2 超聲輔助提取對(duì)琯溪蜜柚果皮中總酚和抗氧化能力的影響

表2 超聲功率對(duì)琯溪蜜柚皮中酚酸的影響Table 2 Effect of ultrasonic treatment power on the content of total phenolic acids in extracts from Guanxi pomelo peel

圖2 超聲時(shí)間對(duì)琯溪蜜柚果皮中總酚含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the content of total phenolic acids in extracts from Guanxi pomelo peel

由圖2可知，超聲時(shí)間和溫度對(duì)總酚含量有顯著的影響。隨著超聲時(shí)間和溫度的增加，總酚含量顯著增加，在30℃和40℃超聲處理30min，總酚含量較超聲處理10min分別增加了22.32%、22.91%。超聲處理60min，在40℃比30℃總酚含量增加了8.42%，表明在較高的溫度下延長(zhǎng)超聲時(shí)間有利于總酚的提取。超聲功率對(duì)總酚含量也有積極的影響。

圖3 超聲功率對(duì)琯溪蜜柚果皮中總酚含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment power on the content of total phenolic acids in extracts from Guanxi pomelo peel

由圖3可知，當(dāng)超聲功率從3.2W增加到56W時(shí)，總酚含量增加了20.92%。這與上述超聲處理對(duì)單個(gè)酚酸含量的影響結(jié)果不一致。由于總酚評(píng)價(jià)的是琯溪蜜柚果皮提取物中所有酚類物質(zhì)的總量，包括類黃酮和酚酸組分，而類黃酮具有較高的熱穩(wěn)定性，此外，類黃酮的含量比酚酸明顯高。因此，超聲處理后，總酚含量可能與類黃酮具有相同的增加趨勢(shì)。

圖4 總酚和抗氧化能力的相關(guān)性Fig.4 Correlation between the content of total phenolic acids and TEAC value

圖4表明了總酚與抗氧化能力的相關(guān)性?？偡雍颗cTEAC值有良好的線性關(guān)系。在30、40℃的提取溫度(分別在10、20、30、45、60min測(cè)定)和4個(gè)超聲功率(3.2、8、30、56W)水平下，R2依次為0.8832、0.8874、0.9397。TEAC越高，其抗氧化能力越強(qiáng)，而TEAC值與總酚含量呈正相關(guān)，表明琯溪蜜柚皮中提取物的抗氧化性可能與總酚有關(guān)。通過(guò)上述結(jié)果可以看出，超聲處理可以顯著的提高琯溪蜜柚果皮提取物的抗氧化性。

3 結(jié) 論

酚酸在植物中的存在狀態(tài)比較復(fù)雜，柑橘水果中的酚酸大部分以結(jié)合態(tài)的形式存在。通過(guò)酸解結(jié)合態(tài)酚酸，研究了超聲處理對(duì)游離酚酸含量的影響。結(jié)果表明：超聲處理對(duì)酚酸含量有顯著的影響，隨著處理時(shí)間和溫度的增加，酚酸含量顯著增加，當(dāng)溫度從30℃增加到40℃，超聲處理30min，7種酚酸含量的增幅在3.76%～38.18%之間，其中對(duì)香豆酸的含量增加最高。在30℃的溫度下，超聲時(shí)間從10min增加到30min，咖啡酸、芥子酸含量增幅最大，分別增加了13.14%、15.24%；但隨著處理溫度和提取時(shí)間的增加，造成 7種酚酸含量顯著下降，其中咖啡酸、對(duì)香豆酸含量降幅最大，分別下降了33.39%、46.14%，因此，應(yīng)用超聲輔助提取酚酸類物質(zhì)時(shí)選擇合適的超聲條件是非常重要的。在本文的研究條件下，超聲波提取柑橘皮中酚酸的最佳超聲條件為：溫度30℃、時(shí)間40min、功率56W。

超聲處理能顯著提高橘皮中的總酚含量及抗氧化性。在30℃和40℃超聲處理30min，總酚含量較超聲處理10min分別增加了22.32%、22.91%；當(dāng)超聲功率從3.2W增加到56W時(shí)，總酚含量增加了20.92%。超聲處理后總酚與抗氧化能力呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，在30、40℃的提取溫度(分別處理10、20、30、45、60min)和4個(gè)超聲功率(3.2、8、30、56W)水平下，R2依次為0.8832、0.8874、0.9397。表明琯溪蜜柚皮中提取物的抗氧化性可能與總酚有關(guān)，超聲處理能有效地增強(qiáng)抗氧化能力。

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Effect of Ultrasonic Treatment on Phenolic Acid Content and Antioxidant Capacity of Guanxi Pomelo Peel Extract

MA Ya-qin1，YE Xing-qian2，WU Hou-jiu1，WANG Hua1，SUN Zhi-gao1
(1. National Citrus Engineering Research Center, Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China；2. School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

Ultrasound technology was applied to extract phenolic components from Guanxi pomelo peels. Effects of ultrasonic treatment parameters including ultrasonic treatment time, ultrasonic treatment temperature and ultrasonic treatment power on the content and antioxidant capacity of phenolic acids were explored. Totally 7 phenolic acids were determined by HPLC-PDA.Folin-Ciocalteu method and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay were adopted to evaluate the antioxidant capacity of the extracts obtained by ultrasonic treatment. The results showed that sinapic acid content was the highest in Guanxi pomelo peels, and the contents of seven phenolic acids were increased with the increase of treatment time and temperature. However, the contents of phenolic acids exhibited a decrease after ultrasonic treatment at 40 ℃ for 60 min. Ultrasonic treatment power revealed a positive effect on the contents of phenolic acids. Furthermore, ultrasonic treatment parameters had significantly effect on the content of total phenolic acids. A linear relationship was observed between Trolox-equivalent antioxidant capacity(TEAC) value and the content of total phenolic acids after ultrasonic treatments with correlation coefficients of 0.8832 at 30 ℃,0.8874 at 40 ℃ (the length of treatment time varied from 10, 20, 30, 45 to 60 min at both temperature levels), and 0.9397 at four ultrasonic power levels, respectively. Therefore, the antioxidant activity of Guanxi pomelo peel extract was correlated with the content of total phenolic acids, and obviously improved by ultrasonic treatment.

ultrasonic treatment；Guanxi pomelo peels；phenolic acids；antioxidant capacity

TS201.1

A

1002-6630(2011)07-0025-05

2010-06-09

柑橘學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(CKLC200805)

馬亞琴(1978—)，女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：myaya211@163.com