岑劍偉，李來好，楊賢慶，郝淑賢，魏 涯，辛少平，石 紅，周婉君

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300)

高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中呋喃西林的研究

岑劍偉，李來好*，楊賢慶，郝淑賢，魏 涯，辛少平，石 紅，周婉君

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300)

建立了高效液相色譜測定水產(chǎn)品中呋喃西林殘留量的方法。通過對比不同有機溶劑的提取效果，表明使用單溶劑提取回收率均不高，采用丙酮和二氯甲烷的混合溶液提取效果更好，其中比例為3∶7時最佳。比較了振蕩法、超聲波法和超聲波加熱法等的提取能力，結(jié)果表明，超聲波加熱法提取效果最好。以丙酮－二氯甲烷作為提取劑、超聲波加熱(35kHz，強度100%，40℃)進(jìn)行提取，提取時間15min、提取2次，提取率可達(dá)90%以上，方法回收率在75%～100%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，檢測限能達(dá)到0.5μg/kg。本方法操作簡便，回收率較高，穩(wěn)定性好。

呋喃西林，超聲波提取，高效液相色譜

呋喃西林(Nitrofurazone)是一種具有5－硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥，主要通過干擾細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于家禽、家畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖動物傳染病的預(yù)防和治療，也被作為飼料藥物添加劑。上世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)具有致畸、致突變和致癌作用，由于其代謝產(chǎn)物始終存在，嚴(yán)重危害人體健康，世界各國均嚴(yán)禁在治療和飼料中使用。歐盟在1995年就規(guī)定禁止在食物中使用該類藥物，并于2003年確定水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測限為1μg/kg［1］。我國也于2002年開始禁止在所有食品動物中使用硝基呋喃類抗生素。目前，對于食品中呋喃西林的檢測方法，大多是針對呋喃西林代謝物的檢測方法［2－4］。研究表明，在食品、環(huán)境中氨基脲(SEM)并不是單一由呋喃西林代謝而來，還可能是因為包裝或加工過程中其他污染源造成的，歐盟食品委員會也對SEM的毒性重新進(jìn)行了界定，目前不再將SEM作為判斷呋喃西林污染的唯一標(biāo)準(zhǔn)［5］。通過檢測氨基脲含量來代表呋喃西林的使用情況并不是很準(zhǔn)確，因而有必要建立關(guān)于呋喃西林原藥的檢測方法，以便更好地發(fā)現(xiàn)和監(jiān)管呋喃西林在水產(chǎn)養(yǎng)殖中非法使用的情況。呋喃西林檢測方法主要有免疫檢測法和理化檢測法兩類，免疫檢測法特異性好、靈敏度高、精密度高，樣品前處理簡單，操作簡便，不需要大型儀器設(shè)備，但其經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果［6－7］;理化檢測方法有紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等［6］。紫外分光光度法、薄層色譜法由于靈敏度低已逐漸淘汰，高效液相色譜法雖然靈敏度能夠達(dá)到檢測要求但往往樣品處理過程復(fù)雜，液質(zhì)聯(lián)用法測定則所需設(shè)備昂貴，檢測成本較高，同時也存在樣品處理過程復(fù)雜等的缺點［8］。本文重點研究水產(chǎn)樣品前處理方法，提升樣品的呋喃西林的提取率，利用高效液相色譜檢測，建立快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高的水產(chǎn)品中呋喃西林殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚、南美白對蝦 市售;呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)品Dr.Ehrenstorfer公司;二氯甲烷、甲醇、乙腈 色譜純，德國默克;其他試劑 均為分析純;實驗用水 符合GB/T6682一級水標(biāo)準(zhǔn)。

AgiLent1100高效液相色譜 美國安捷倫公司; N－1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 EYELA日本東京理化;TDZ5－WS自動平衡離心機 湖南湘儀儀器公司;Transonic TI－H10超聲波清洗儀 強度100%，德國 Elma; N－EVAPTM112氮吹儀 美國Organomation;GB204分析天平 瑞士梅特勒。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制 丙酮－二氯甲烷提取液:取丙酮與二氯甲烷按體積比(3∶7)混合;標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液: 100μg/mL，稱取呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，加入乙腈溶解，定容到100mL，4℃貯存;標(biāo)準(zhǔn)工作液:取標(biāo)準(zhǔn)貯備液，加50%乙腈水溶液稀釋配制成濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2μg/mL的梯度系列。

1.2.2 樣品前處理 將樣品攪碎或均質(zhì)，稱取10.00g于100mL離心管中，加提取液20mL，再加入無水硫酸鈉(10g)，充分搖勻，按下文研究方法提取后，4500r/min離心5min，取上清液，沉淀再加入20mL提取液重復(fù)提取1次。合并上清液于蒸餾瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃水浴減壓蒸餾至近干，加入2mL 50%乙腈水溶液洗瓶，取洗液過0.22μm濾膜，備用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB－C18，250mm×4.6mm(5μm);流動相A:乙腈;流動相B:超純水;進(jìn)樣量:20μL;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;檢測信號:365nm。使用梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4 計算公式 樣品中呋喃西林含量計算公式為:

式中:X－樣品中呋喃西林的含量，μg/kg;C－提取液中呋喃西林的含量，μg/mL;V－樣品液最終定容體積，mL，本方法為2mL;M－樣品的稱取量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

實驗中分別使用二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙腈和乙酸乙酯等溶劑提取魚肉組織，發(fā)現(xiàn)回收率均較低(小于60%)。二氯甲烷、乙酸乙酯提取時樣品液較為干凈，而用乙腈、丙酮或甲醇提取使得提取液中含大量蛋白等雜質(zhì)，在后續(xù)蒸餾步驟中容易引起爆沸。另外，乙酸乙酯、乙腈蒸餾時所需溫度較高，長時間高溫處理會導(dǎo)致呋喃西林降解，引起實驗誤差。有文獻(xiàn)報道，使用丙酮與二氯甲烷的混合溶液提取，可以提高回收率［10］。對比不同比例的丙酮和二氯甲烷混合液的提取效果，結(jié)果如表2所示。單獨使用二氯甲烷或純丙酮提取回收率很低，但丙酮與二氯甲烷按一定比例混合提取時，回收率有較明顯的提高，當(dāng)丙酮比例在20%～50%之間時，回收率達(dá)到85%以上，且較穩(wěn)定。另外，從回收率角度看，丙酮比例在20%附近時回收率波動比較大，而在加熱提取過程中溶劑的蒸發(fā)不可避免，對提取的穩(wěn)定性會造成一定的影響。30%附近時則變化比較平緩，溶劑蒸發(fā)對之影響較小，故選取丙酮與二氯甲烷(3∶7)混合液作為提取液。

表2 不同比例混合提取液提取效果比較

2.2 提取方法的研究

2.2.1 提取方法比較 將空白魚肉與呋喃西林標(biāo)樣充分混合，稱取10.00g加標(biāo)樣品，加入20mL丙酮∶二氯甲烷(3∶7)提取液，分別用振蕩(230r/min)、超聲波(35kHz，強度100%)、超聲波加熱(35kHz，強度100%，40℃)三種方法提取一次，處理不同時間，濃縮提取液，測定提取總量，如表3所示結(jié)果，超聲波提取比振蕩提取的能力強，超聲波加熱輔助提取效果更好，15min之后提取量基本保持穩(wěn)定。2.2.2 超聲波提取率 將空白魚肉攪碎加入呋喃西林充分混合，放置一段時間，稱取10.0g加標(biāo)樣品，加入20mL丙酮∶二氯甲烷(3∶7)提取液，于超聲波加熱(35kHz，強度100%，40℃)提取15min，提取4次，分別測定每次提取液中所提取出呋喃西林的量，做4個平行。結(jié)果如表4所示，在設(shè)定條件下，提取1次提取率接近70%，提取2次后樣品中呋喃西林含量已經(jīng)很低，前兩次提取量占總提取量的90%以上。重復(fù)提取兩次已經(jīng)能滿足分析的要求，因此對樣品處理時超聲波提取兩次即可。

表4 超聲波熱輔助提取

2.3 方法評價

2.3.1 方法線性范圍和檢測限 配制呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)工作液，用液相色譜分析，測定不同濃度工作液的峰面積，并做峰面積－濃度校正曲線，獲得曲線方程為: Area=96.409Amount－0.00034，相關(guān)系數(shù)為:0.99998。呋喃西林在0.005～2μg/mL范圍內(nèi)線性良好。校正曲線圖與標(biāo)準(zhǔn)色譜分別見圖1、圖2。

圖1 校正曲線圖

以0.005μg/mL濃度的呋喃西林溶液進(jìn)樣測定，計算得對應(yīng)信噪比(S/N)為12，將濃度降低1倍進(jìn)樣分析，色譜峰較小，S/N值小于3。因而擬定以檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點方法為該法的檢測限為0.005μg/mL，換算為水產(chǎn)樣品對應(yīng)值為0.5μg/kg，與本方法定量下限值相同。

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度 稱取10g攪碎樣品，分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，以丙酮－二氯甲烷為提取液，超聲加熱提取，按以上最佳條件操作測定。另外做一份空白對照，實驗結(jié)果見表5。本方法回收率在75%～100%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，方法回收率高、穩(wěn)定性好。按本方法提取，魚肉和蝦肉的樣品色譜圖均較干凈，魚肉樣品色譜圖雜質(zhì)峰比蝦肉樣品更少。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖、蝦空白樣品及加標(biāo)樣品見圖2。

3 討論

3.1 提取液

本文比較了二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙腈和乙酸乙酯等有機溶劑提取水產(chǎn)品中呋喃西林的效果，發(fā)現(xiàn)單溶劑的提取效果均不好，回收率較低。但使用丙酮和二氯甲烷混合溶劑提取時，回收率顯著提高，丙酮比例在20%～50%之間的提取效果均較好，回收率高且較穩(wěn)定。吳富忠等認(rèn)為丙酮比例超過20%時提取液中部分水不能脫去而影響測定結(jié)果［10］，但按照本文操作，提取時即加入足量無水硫酸鈉脫水不存在類似問題。本文中使用丙酮和二氯甲烷混合液提取，提取液較干凈，因而可以直接進(jìn)樣，無需再做進(jìn)一步的純化和凈化，簡化了操作。

表5 方法回收率

圖2 色譜圖

3.2 提取方法

以振蕩、超聲波、超聲波熱輔助等提取方法做比較，發(fā)現(xiàn)超聲波與振蕩相比較，超聲波作用更有利于呋喃西林從肉組織中溶解出來，前者的提取能力更強。超聲波再輔以加熱進(jìn)行提取，提取效率更高，可有效縮短操作時間，但仍需作用15～20min才能達(dá)到峰值。本文以超聲波輔以加熱的方法提取，提取15min，提取兩次可將樣品中90%以上的呋喃西林提取出來。但在測定方法回收率時，往往會低于此值，分析其可能原因是呋喃西林與生物樣品接觸后，在酶的作用下部分被降解，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低甚至出現(xiàn)假陰性。因此，在操作過程中樣品盡量避免長時間置于常溫下，不能及時處理的樣品應(yīng)在低溫下凍存。

本文研究了水產(chǎn)樣品中呋喃西林殘留量的提取方法，以丙酮－二氯甲烷作為提取液，超聲波輔助加熱法提取，提取效果最好，樣品提取液雜質(zhì)少，不需要后續(xù)凈化步驟;方法回收率在75%～100%之間，穩(wěn)定性好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，檢測限能達(dá)到0.5μg/kg。與超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(0.3μg/kg)接近［13］，但樣品處理過程中不需要使用固相萃取等步驟，操作更為簡化。該法除了可以應(yīng)用于水產(chǎn)品中呋喃西林含量的檢測，同樣也可作為飼料中呋喃西林檢測方法的參考。

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Determination of nitrofuran residues in aquatic products by HPLC method

CEN Jian－wei，LI Lai－h(huán)ao*，YANG Xian－qing，HAO Shu－xian，WEI Ya，XIN Shao－ping，SHI Hong，ZHOU Wan－jun
(South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China)

A High－performance liquid chromatography(HPLC)method for the nitrofuran residues in aquatic products was proposed.Extracted by methylene chloride，acetone，methanol，acetonitrile and ethyl acetate respectively，the recovery rate of nitrofuran cannot meet the requirement.Better result could be acquired by extracting with a mixed solution of acetone and dichloromethane，while the ratio was 3∶7.Ultrasonication assisted by heating was the best method for facilitating the extraction，comparing with oscillation，ultrasonication methods. Extracted with Acetone－dichloromethan agent，ultrasonication assisted by heating(35kHz，intensity 100%，40℃)，treated twice with 15min each time，the nitrofuran can be extracted well，the extraction rate was higher than 90%.A method，of simplicity，high recovery and good stability，which the recovery was 75%～100%，the relative standard deviation was less than 10%，and the detection limit can reach 0.5μg/kg was attained.

nitrofurazone;ultrasonic extraction;high－performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0455－04

2011－08－30 *通訊聯(lián)系人

岑劍偉(1976－)，男，研究生，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。

國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS－49);國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2010GB23260577，2009GB2E200303，2010GB2E000335); 廣 東 省 科 技 計 劃 項 目(2009A020700004，2008A020100006，2009B020201003);廣東省海洋漁業(yè)科技推廣項目(A200899B02，A200901C01);農(nóng)業(yè)部中央級公益性科研院所基本科研項目(2010YD07)。