周 希， 黃曉燕， 陳長曦， 陳必成， 龔永生， 楊德業(yè)△

(溫州醫(yī)學院1附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科, 心血管生物和基因研究所，2附屬第一醫(yī)院外科實驗中心,3基礎學院機能實驗中心，浙江 溫州 325000)

Pax-8基因真核表達載體的構建及其功能的初步研究*

周 希1， 黃曉燕1， 陳長曦1， 陳必成2， 龔永生3， 楊德業(yè)1△

(溫州醫(yī)學院1附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科, 心血管生物和基因研究所，2附屬第一醫(yī)院外科實驗中心,3基礎學院機能實驗中心，浙江 溫州 325000)

目的構建大鼠Pax-8基因全長序列的真核表達載體pcDNA3.1(+)，并將重組質粒轉染至心肌細胞系H9c2中進行表達，測定轉染后Pax-8基因對心肌細胞增殖及凋亡的影響。方法酶切pCMV sport6-Pax-8獲得大鼠Pax-8全長基因，通過基因重組技術將其插入到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構建重組質粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鑒定和DNA測序鑒定插入片段。將重組質粒經(jīng)脂質體法轉染至大鼠心肌細胞系H9c2細胞中，RT-PCR法及Western blotting法分別檢測轉染后Pax-8 mRNA及蛋白表達水平。CCK-8法檢測細胞增殖；以血清饑餓誘導心肌細胞凋亡，同時進行Pax-8質粒轉染，流式細胞儀檢測細胞凋亡指數(shù)，Western blotting法檢測活化caspase-3的表達。結果成功構建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表達載體，且證實轉染后心肌細胞的Pax-8 mRNA 及蛋白表達均明顯高于空白對照組(P<0.05)及空質粒組(P<0.05)。轉染Pax-8基因能提高心肌細胞的增殖能力(P<0.05)，明顯抑制血清饑餓引起的細胞凋亡(P<0.01)，同時下調活化caspase-3的表達(P<0.01)。結論通過基因重組技術成功使得Pax-8基因在心肌細胞中過表達。Pax-8基因可能通過促進心肌細胞增殖及抑制心肌細胞凋亡從而參與胚胎心臟發(fā)育的過程。

基因，Pax-8; 真核表達; 細胞凋亡; 細胞增殖

室間隔缺損是最常見的先天性心臟病之一。盡管胚胎心臟發(fā)育已成為近年來國內(nèi)外學者的研究熱點，但其確切的分子機制至今仍然知之甚少。近年，國外的研究表明：骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體ⅠA(bone morphogenetic protein receptorⅠA,BMPRⅠA，又名ALK3)在心臟發(fā)育及心肌細胞的分化中起重要作用，并與室間隔缺損形成有關[1,2]。Gaussin等使用Fukushipe等創(chuàng)立的α-MHC-Cre/lox P系統(tǒng)完成了心臟特異的ALK3基因敲除，發(fā)現(xiàn)純合子小鼠皆死于胚胎中期，并伴有室間隔缺損，心內(nèi)膜墊和肌小梁發(fā)育不全[3,4]。楊德業(yè)等[5,6]利用基因芯片篩選ALK3下游基因，獲得候選基因Pax-8表達下調7.1倍；且Pax-8基因敲除的純合子小鼠心臟存在室間隔缺損，凋亡增加的現(xiàn)象。通過RNA干擾技術體外干擾心肌細胞Pax-8基因的表達，高瞻等[7]則發(fā)現(xiàn)心肌細胞凋亡增加，增殖受到抑制。

本研究則通過克隆Pax-8基因全長序列，并對其進行基因重組，從而構建含有Pax-8基因全長序列的真核表達載體，并將其轉染至大鼠H9c2心肌細胞中，用RT-PCR及Western blotting方法分別在mRNA和蛋白水平證實其在心肌細胞的過度表達，并測定轉染Pax-8基因后對心肌細胞增殖和凋亡蛋白caspase-3的影響，從正面進一步證實Pax-8在心肌細胞凋亡中的作用。

材 料 和 方 法

1細胞與試劑

質粒pCMV sport6-Pax-8 購自ATCC；KpnI、NotI和PmeI限制性內(nèi)切酶購自NEB；膠回收試劑盒購自Axygen；DH5α菌種，超級感受態(tài)細胞制備試劑盒購自碧云天生物技術研究所；LB培養(yǎng)液、LB/Amp液體及固體培養(yǎng)基均購自上海生工生物工程有限公司；質粒抽提試劑盒購自Omega；T4連接酶購自Promega；pcDNA3.1(+)質粒和Lipofectin2000購自Invitrogen，大鼠H9c2心肌細胞株購自中科院上海細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購自Gibico；逆轉錄PCR試劑盒購自Fermanats；CCK-8細胞計數(shù)試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所；抗大鼠caspase-3抗體購自Cell Signaling；抗大鼠Pax-8抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗鼠IgG購自Abcam。

2方法

2.1超級感受態(tài)細胞的制備 根據(jù)超級感受態(tài)制備試劑盒制備E.coliDH5α感受態(tài)，并測定轉化效率。

2.2重組pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表達載體的構建 質粒pCMV sport6-Pax-8于LB/Amp固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個克隆，LB/Amp液體培養(yǎng)基中37 ℃、150-170 r/min培養(yǎng)16 h，提取質粒。根據(jù)pCMV sport6和pcDNA3.1(+)多克隆位點圖譜及基因序列的酶切位點選擇KpnI、NotI對2個質粒分別進行酶切，分別獲得Pax-8全長基因序列，及帶有同樣黏性末端的pcDNA3.1(+)空載體。膠回收純化后，T4連接酶連接目的片段與pcDNA3.1(+)載體，4 ℃連接過夜，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞, LB/Amp培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，根據(jù)質粒抽提試劑盒說明書抽提質粒，經(jīng)PmeI酶切鑒定后，送上海Invitrogen公司測序。

2.3H9c2心肌細胞的培養(yǎng) 大鼠心肌細胞株(H9c2)用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞生長至約70%-90%的融合狀態(tài)用于實驗。

2.4脂質體轉染 實驗分空白對照組：即未作任何處理(圖中命名wild-type組)；空質粒組：轉染1 μg pcDNA空載體組(圖中命名H9c2-pcDNA3.1組)；實驗組：轉染1 μgPax-8重組質粒組(圖中命名H9c2-Pax-8組)。根據(jù)Invitrogen公司提供的轉染操作說明書進行。轉染前24 h將細胞以2×105的密度接種于6孔板中，轉染時用無血清DMEM洗滌細胞3次，加入質粒與脂質體的復合物，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后更換含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，24 h后進行下一步實驗檢測。

2.5轉染效率測定 以上述相同條件方法轉染帶綠色熒光蛋白的pEGFP質粒1 μg，48 h后，共聚焦拍照，計數(shù)發(fā)綠色熒光細胞數(shù)及相同視野下細胞總數(shù)，轉染效率=(綠色熒光細胞數(shù)/相同視野普通光鏡下細胞總數(shù))×100%。

2.6細胞總RNA 提取 按實驗室常規(guī)方法進行。棄培養(yǎng)液，加1 mL Trizol/2×106cells，裂解細胞;細胞裂解物轉移到2 mL Eppendorf 管中，室溫放置5 min;加0.2 mL 氯仿/1 mL Trizol，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃離心，細胞裂解液分為3層；小心吸取上層水相轉移到新的1.5 mL Eppendorf 管中，加0.5 mL 異丙醇/1 mL Trizol，室溫放置10 min，4 ℃離心；小心去掉上清，加1 mL 75%乙醇洗白色沉淀物，離心后去掉乙醇，空氣干燥約10 min；用10-20 μL DEPC 處理過的水重懸RNA，測量1∶100 稀釋樣品的吸光度(A260)，RNA濃度(mg/L)=稀釋度×40 mg/L×A260，瓊脂糖凝膠電泳濃度鑒定RNA質量，重懸的RNA 放置-80 ℃冰箱保存。

2.7逆轉錄聚合成第1鏈 使用逆轉錄酶MMLV合成第1鏈，根據(jù)公司提供的說明書進行。取3 μg總RNA與Oligo dT在70 ℃反應5 min，置于冰上，加入dNTP、5×buffer、RNase inhibitor，37 ℃反應5 min，加入逆轉錄酶MMLV，42 ℃反應1 h，72 ℃反應10 min終止反應。測量1∶100 稀釋樣品的A260來計算濃度，樣品濃度(mg/L)=稀釋度×40 mg/L×A260。以1 μg的逆轉錄產(chǎn)物作為模板，按如下條件進行PCR反應。

2.8PCR擴增目的基因 根據(jù)基因編號在GenBank中尋找該基因對應的cDNA全序列，使用Primer5.0篩選出分數(shù)較高的引物；運用Oligo 6.2評價引物的GC含量、Tm值、引物二聚體和錯配等參數(shù)，選擇較好的引物；再通過PubMed-Blast比較同源性，確保引物的特異性。Pax-8上游引物序列5’-CGGCAACGCATTGTGGA-3’,下游引物序列5’- TCCTGGGCTCAGAGATTTGG-3’，產(chǎn)物378 bp。GAPDH 作為內(nèi)參照， 上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游引物為5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3’, 產(chǎn)物 123 bp。Pax-8 反應條件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35 個循環(huán),72 ℃10 min。GAPDH 反應條件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,54 ℃30 s,72 ℃1 min,28個循環(huán),72 ℃ 10 min。在PCR反應達到平臺期之前終止以達到半定量作用。每組取10 μL PCR 產(chǎn)物用于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳,用Quantity One 凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)進行半定量分析。

2.9Western blotting 檢測Pax-8 蛋白質表達 轉染后48 h,裂解細胞提取蛋白質,BCA 法測定蛋白濃度,各組上樣50 μg,行10%SDS-PAGE 電泳,轉膜, 5 %脫脂牛奶室溫封閉1.5 h。小鼠抗大鼠Pax-8 抗體(1∶100) 4 ℃孵育過夜,TBST 溶液洗膜3次,每次10 min。室溫下加入兔抗小鼠IgG抗體(1∶2 000) 孵育1.5 h,洗膜3 次。用增強化學發(fā)光法顯色,X 線片曝光顯影。以GAPDH 作為內(nèi)參照標化Pax-8 蛋白質表達。用Quantity One 凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

2.10CCK-8檢測轉染后細胞增殖能力 本實驗分轉染重組Pax-8質粒組、相同量空質粒轉染組及空白組，轉染后48 h，以0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞,加入1 mL培養(yǎng)液重懸后計數(shù)。以6 000 cells/well接種到96孔培養(yǎng)板, 分組再培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8 細胞計數(shù)試劑，于37 ℃孵育4 h，酶標儀450 nm下讀取吸光度A450值。

2.11細胞凋亡的流式檢測 以不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞48 h，造成血清饑餓誘導心肌細胞凋亡模型，同時進行Pax-8質粒及相同量空質粒轉染，分組：(1)正常細胞組；(2)陰性對照組：轉染相同量空質粒的正常細胞組；(3)轉染重組Pax-8質粒的心肌細胞凋亡模型組；(4)轉染相同量空質粒的心肌細胞凋亡模型組。轉染后48 h，將培養(yǎng)基中懸浮的細胞以及用0.05%胰酶消化下來的貼壁細胞收集在一起，用PBS將細胞重懸，計數(shù)1×105個細胞按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書對細胞進行Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色。使用流式細胞儀進行檢測(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)，Annexin V單陽性為早期凋亡細胞,以對照組早期凋亡率為100%,計算各組與對照組早期凋亡率之比。

2.12Western blotting 檢測activated caspase-3蛋白表達 取方法2.11中各組細胞，裂解細胞提取蛋白質,BCA 法測定蛋白濃度,各組上樣50μg,行10%SDS-PAGE 電泳,轉膜,7.5 %脫脂牛奶室溫封閉2.5 h。兔抗大鼠活化caspase-3 抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜,TBST 溶液洗膜3 次,每次10 min。室溫下加入山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000) 孵育1.5 h,洗膜3 次。用增強化學發(fā)光法顯色,X 線片曝光顯影。以GAPDH 作為內(nèi)參照標化活化caspase-3蛋白表達。用Quantity One 凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1Pax-8基因全長序列的獲得

pCMV sport6-Pax-8質粒經(jīng)KpnI及NotI雙酶切后獲得Pax-8全長序列，可見在2 500 bp與3 000 bp之間出現(xiàn)1條清晰單一的條帶，與GenBank報道Pax-8基因全長堿基數(shù)2 567 bp相符,見圖1A。凝膠回收全長片段后純化，重新電泳鑒定，與酶切結果位置一致，條帶清晰單一,見圖1B。

Figure 1. The full length of ratPax-8 gene. A ：the plasmid vector pCMV sport6 and the full length cDNA fragment ofPax-8 were cleaved byKpnI andNotI; B： the full length ofPax-8 cDNA was purified by gel extraction. Gel electrophoresis showed a single clear 2 567 bp fragment.

圖1大鼠Pax-8基因全長序列電泳圖

2pcDNA3.1(+)-Pax-8重組質粒的獲得及鑒定

pcDNA3.1(+)與全長Pax-8序列經(jīng)T4連接

酶連接、轉化感受態(tài)篩選獲得陽性克隆，提取質粒，Pax-8引物對質粒進行PCR獲得1條長約378 bp的目的片段(圖2A)、PmeI酶切鑒定(圖2B箭頭所指)初步證實插入的片段為Pax-8基因，測序確認(圖2 C)。

3重組pcDNA3.1(+)-Pax-8質粒轉染H9c2心肌細胞

激光共聚焦顯微鏡測定轉染效率：轉染帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pEGFP質粒，通過檢測發(fā)綠色熒光細胞數(shù)與同一視野下普通光鏡細胞總數(shù)的比率，測定轉染效率平均約為72%,見圖3。過表達效率：與對照組(mRNA為0.57±0.12，蛋白為0.82±0.04)相比，轉染Pax-8組 (mRNA為1.47±0.34，蛋白水平為1.21±0.25)其Pax-8表達在mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與空質粒組(mRNA為0.43±0.19，蛋白為0.84±0.06)相比，轉染組Pax-8表達mRNA與蛋白水平也顯著升高(P<0.05)?？召|粒組與空白組的Pax-8 mRNA 和蛋白質表達均無顯著差異，見圖4、5。

Figure 2. Recombinant plasmid construction and identification. A：screening for the positive colonies containing the inserted fragment by colony-PCR-a 378 bp fragment was obtaind by gel electrophoresis; B: The positive colonies were amplified, extracted, purified and identified byPmeI endonuclease cleavage; C: the sequences of the inserted fragments were confirmed by automated sequencing using ABI Prism 7700 sequence detector.

圖2pcDNA3.1(+)-Pax-8重組載體鑒定

4Pax-8對心肌細胞增殖的影響

采用CCK-8法檢測心肌細胞增殖，結果顯示(圖6)與轉染空質粒組相比，轉染Pax-8組可促進心肌細胞的增殖，且差異顯著(P<0.01)。

5Pax-8對血清饑餓誘導心肌細胞凋亡的影響

與空白對照組及陰性對照組比,血清饑餓能誘導心肌細胞凋亡(P<0.01)，而轉染Pax-8基因能明顯抑制血清饑餓所引起的細胞凋亡(P<0.01),見圖7。

6Pax-8對損傷的心肌細胞活化caspase-3蛋白表達的影響

與正常組比，血清饑餓組活化caspase-3的表達明顯上調，而Pax-8基因轉染能有效抑制活化caspase-3的表達，差異顯著,見圖8。而正常組與空質粒轉染組比則無顯著差異。

Figure 3. Detecton of the transfection efficiency. pEGFP vector was transfected into the H9c2 cells. After 48 h incubating, GFP was detected by laser confocal microscopy. The transfection efficiency was about 72%.n=3.

圖3轉染帶綠色熒光蛋白質粒pEGFP，48h后激光共聚焦顯微鏡測定轉染效率

Figure 4. Expression of Pax-8 mRNA in the wild-type(lane 1) and transfected H9c2 cells. H9c2 cells were transfected with an empty pcDNA3.1 expression vector(lane 2) or containing thePax-8 gene(lane 3),GAPDH served as the internal control.**P<0.01vswild-type and H9c2-pcDNA3.1.

圖4Pax-8mRNA在心肌細胞內(nèi)的表達

討 論

先天性心臟病是一類由于胎兒時期心臟發(fā)育障礙而導致心臟形態(tài)、功能異常的疾病。目前通過對心臟發(fā)育的研究來揭示先天性心臟病的發(fā)病機制已經(jīng)成為熱點之一，但其根本原因尚未徹底明了。盡管如此，近年來科學研究表明先天性心臟病的主要原因可分為遺傳因素和環(huán)境因素連累，其中染色體畸變?nèi)?1-三體綜合征可出現(xiàn)心內(nèi)膜墊缺損、室間隔缺損、房間隔缺損和法樂氏四聯(lián)癥等。1條染色體包含很多基因，因此精確定位異?；驗榛蛑委熛忍煨孕呐K病奠定了基礎。

Figure 5. Expression of Pax-8 protein in the wild-type(lane 1) and transfected H9c2 cells. H9c2 cells were transfected with an empty pcDNA3.1 expression vector(lane 2) or containing thePax-8 gene(lane 3).GAPDH served as the internal control.*P<0.05vswild-type and H9c2-pcDNA3.1.

圖5Pax-8蛋白在心肌細胞內(nèi)的表達

圖6Pax-8對心肌細胞增殖的影響

轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)在胚胎發(fā)育、細胞分化、器官的形態(tài)發(fā)生和圖式發(fā)育過程中起重要作用。ALK3屬于TGF-β超家族，在心臟發(fā)育及心肌細胞分化中起重要作用。

圖7Pax-8對饑餓誘導的心肌細胞凋亡的影響

美國Baylor醫(yī)學院心臟發(fā)育中心Michael D. Schneider教授使用了α-MHC-Cre/loxP系統(tǒng)創(chuàng)建了心臟特異性ALK3基因敲除，發(fā)現(xiàn)純合子小鼠死于胚胎中期，并伴有室間隔缺損，心內(nèi)膜墊和肌小梁發(fā)育不全，根據(jù)他們的研究，ALK3與室間隔缺損的關系已經(jīng)被闡明。楊德業(yè)等[5,6]利用心臟特異性ALK3敲除純合子小鼠篩選出可能的ALK3下游基因-轉錄因子Pax-8，發(fā)現(xiàn)其在基因ALK3敲除純合子小鼠胚胎心臟中下調了7.1倍，并較特異地表達在純合子小鼠胚胎心臟中。

Figure 8. Effects ofPax-8 transfection on the caspase-3 protein expression of H9c2 cells.It shows that serum deprivation could increase the protein expression of activated caspase-3, while such effect is attenuated byPax-8 transfection.**P<0.01vspcDNA3.1+model;△△P<0.01vsnormal group.

圖8Pax-8對饑餓誘導心肌細胞活化caspase-3蛋白表達的影響

Pax是一個與發(fā)育密切相關的轉錄因子基因家族，Pax基因表達的蛋白在胚胎發(fā)育中對組織和器官的特化起著重要的調控作用。Pax-8屬于哺乳類Pax家族，基因在人類定位于染色體2q12-14，在小鼠定位于染色體2，人和小鼠的Pax-8基因的保守區(qū)結構特征相似,都編碼128個氨基酸的成對結構域(PD),人的Pax-8基因還編碼了保守的八肽(OP)[8,9]。國外研究指出，Pax-8基因在發(fā)育中的甲狀腺、腎臟、腦和成年后甲狀腺、腎臟、Wilm’s瘤中均有表達[10]，且Pax-8基因的時空表達提示其參與了上述器官的形態(tài)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)Pax-8基因敲除純合子小鼠存在室間隔缺損的現(xiàn)象，與雜合子相比純合子小鼠心臟舒張功能下降。

研究表明在胚胎器官發(fā)育中，細胞凋亡扮演著關鍵角色，一旦細胞凋亡規(guī)律失常，心臟發(fā)育也將出現(xiàn)異常甚至導致先天性心臟缺損。Pax-8作為轉錄因子,對甲狀球蛋白啟動子有活化作用, 氧化還原因子-1(Ref-1)增強Pax-8對其的活化作用,免疫反應數(shù)據(jù)顯示,在甲狀腺細胞的細胞核提取物中發(fā)現(xiàn),Ref-1的含量與Pax-8的量呈正相關，Pax-8的DNA結合活化受Ref-1的調節(jié)[11]，而Ref-1在人體組織中廣泛存在,具有修復損傷DNA和調節(jié)多種轉錄因子,間接抗凋亡的作用,因此,Pax-8基因和細胞凋亡存在一定的關系。章佳穎等[12]檢測了Pax-8基因敲除小鼠的心肌細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Pax-8基因敲除純合子小鼠其心肌細胞凋亡程度明顯高于雜合子及正常小鼠，且以室間隔和左右心室壁最甚。

研究發(fā)現(xiàn)，Pax-8基因的RNA干擾可引起H9c2心肌細胞增殖減少，細胞凋亡增加[7]。本研究則成功地通過基因重組技術構建含有Pax-8基因全長序列的真核表達載體，將其轉染至H9c2大鼠心肌細胞中使Pax-8基因過表達。Pax-8基因過表達后心肌細胞的增殖能力增強并能抵抗由血清饑餓引起的凋亡及下調活化caspase-3蛋白的表達。

在胚胎心臟室間隔發(fā)育過程中,心肌細胞凋亡和增殖的平衡是一種有效的生物學調節(jié)機制。據(jù)此我們推測Pax-8基因正是由于參與了心肌細胞的增殖與抗凋亡從而調節(jié)心臟胚胎正常發(fā)育，可能是先天性心臟病-室間隔缺損的重要致病相關基因之一。 然而，Pax-8基因在成年大鼠心肌細胞及原代心肌細胞中是否具有同樣的作用，及其與ALK3基因相關的信號轉導通路，仍有待進一步的研究。

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ConstructionofPax-8generecombinantplasmidandstudyofitsfunction

ZHOU Xi1, HUANG Xiao-yan1, CHEN Chang-xi1, CHEN Bi-cheng2, GONG Yong-sheng3, YANG De-ye1

(1DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,InstituteforCardiovascularBiology&Gene,2CenterofExperimentalSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,3ExperimentalCenterofFunction,SchoolofBasicMedicalSciences,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:Deyeyang203@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of over-expression ofPax-8 gene on the proliferation and apoptosis of H9c2 cells(a cardiomyocyte cell line).METHODSThe full length of ratPax-8 gene was restrictively digested byKpnI andNotI from the pCMV sport6-Pax-8 vector, and then inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). The recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-Pax-8 was confirmed by restriction endonuclease digestion and sequencing. The pcDNA3.1(+)-Pax-8 was transfected into H9c2 cells. The expression ofPax-8 at mRNA and protein levels was identified after transfection by RT-PCR and Western blotting. The cell proliferation was measured by CCK-8. Cell apoptosis was induced by serum deprivation in H9c2 cells transfected withPax-8 gene. The apoptosis rate of the cells was determined by flow cytometry with annexin V-FITC and propidium iodide double staining. The protein expression of activated caspase-3 was measured by Western blotting.RESULTSThe full length ofPax-8 gene was successfully cloned into pcDNA3.1(+) expression vector and over-expression ofPax-8 at mRNA and protein levels was observed in H9c2 cells transfected withPax-8 gene as compared to the wild-type cells and the cells transfected with an empty vector (bothP<0.05). Transfection ofPax-8 gene promoted the proliferation of the cardiomyocytes (P<0.05) and inhibited the apoptosis rates induced by serum deprivation (P<0.01). The expression level of activated caspase-3 was increased by serum deprivation and attenuated byPax-8 transfection (P<0.01).CONCLUSIONThe pcDNA3.1(+)-Pax-8 expression vector was successfully constructed and over-expression ofPax-8 gene in cardiomyocytes is obtained.Pax-8 gene acts as an anti-apoptotic factor in cardiomyocytes by promoting cell proliferation and inhibiting apoptosis.

Genes,Pax-8; Eukaryotic expression; Apoptosis; Cell proliferation

R363

A

1000-4718(2011)03-0430-07

2010-08-26

2010-12-17

國家自然科學基金資助項目(No.30571050)；浙江省溫州市科技發(fā)展計劃資助項目(No.Y2006A017)

△通訊作者 Tel: 0577-88069213; E-mail: Deyeyang203@hotmail.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.003