扈麗娟, 胡曉蕓， 杜 艷， 韓葆芬

(山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 山西 太原 030001)

辛伐他汀對尼古丁誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌t-PA和PAI-1的影響*

扈麗娟, 胡曉蕓△， 杜 艷， 韓葆芬

(山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 山西 太原 030001)

目的研究不同濃度辛伐他汀對尼古丁誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)分泌組織纖溶酶原激活物(t-PA)和1型纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)及其基因表達的影響。方法將3-6代體外培養(yǎng)的HUVECs隨機分為對照組、尼古丁組及不同濃度辛伐他汀組，辛伐他汀組分別以1、10、100 μmol/L辛伐他汀預處理細胞2 h，再以100 μmol/L尼古丁孵育24 h。酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測細胞上清液t-PA和PAI-1含量；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測細胞t-PA和PAI-1 mRNA的表達。結(jié)果尼古丁組PAI-1分泌和mRNA表達較對照組顯著升高(P<0.05)。不同濃度辛伐他汀組PAI-1分泌和mRNA表達均較尼古丁組顯著降低，且PAI-1分泌和mRNA表達的降低呈濃度依賴性(均P<0.05)，以100 μmol/L辛伐他汀組最為顯著。100 μmol/L辛伐他汀組PAI-1分泌和mRNA表達與對照組比較，無顯著差異(P>0.05)。尼古丁組t-PA mRNA表達較對照組顯著降低(P<0.05)。10、100 μmol/L辛伐他汀組t-PA mRNA表達較尼古丁組顯著升高(P<0.05),各組間t-PA分泌無顯著差異(均P>0.05)。結(jié)論在體外，辛伐他汀可降低尼古丁所致的PAI-1分泌和mRNA的表達,并升高t-PA mRNA的表達，從而逆轉(zhuǎn)尼古丁介導的HUVECs纖溶活性減低。

辛伐他??； 尼古??； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； 組織纖溶酶原激活物； 纖溶酶原激活物抑制物1

辛伐他汀是一種膽固醇合成抑制劑，可競爭性抑制膽固醇合成的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutary coenzyme A,HMG-CoA)還原酶，從而減少膽固醇的生物合成，是臨床治療高膽固醇血癥的首選藥物之一。目前，除了其高效、安全的調(diào)脂作用，辛伐他汀的內(nèi)皮保護、穩(wěn)定斑塊和抗炎等作用也日益受到關注[1]。本實驗擬觀察不同濃度辛伐他汀對尼古丁誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分泌組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,t-PA)和1型纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)及其mRNA表達的影響，探討其是否能減輕尼古丁所致的HUVECs纖溶損害及其作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

辛伐他汀為默沙東公司產(chǎn)品；尼古丁購于Sigma； HUVECs株購于上海門諜塔生物科技發(fā)展有限公司，為ATCC來源細胞株；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶和HEPES均購于Gibco；特級胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購于杭州四季青生物制品公司；t-PA和PAI-1含量酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于上海太陽生物技術(shù)公司。Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcript-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。PCR引物及內(nèi)參照GAPDH引物由上海生工生物工程公司合成。

2方法

2.1HUVECs 的體外培養(yǎng) HUVECs復蘇，加入含10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至80%-90%融合時，以0.25%胰蛋白酶消化約1.5 min，以1∶2傳代，3-6代用于實驗。倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察并攝片。

2.2實驗分組 選擇對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度為 5×108cells/L,加入24 孔板,每孔3 mL，每組設立4個復孔。待細胞生長至80%融合狀態(tài)后，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞同步化。貼壁細胞隨機分為5組：(1)對照組：培養(yǎng)液中加入與尼古丁相同體積的無菌PBS液；(2)尼古丁組：培養(yǎng)液中加入100 μmol/L尼古丁作用24 h；(3)不同濃度辛伐他汀組：先將脂溶性辛伐他汀片4.3259 mg(40 mg/片，相對分子質(zhì)量432.59)溶于100 μL無水乙醇，加入150 μL NaOH(1 mol/L)50 ℃孵育2 h，用0.1 mol/L HCl調(diào)pH值至7.2，加雙蒸水至10 mL，即制得終濃度為1 mmol/L的儲存液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存，備用。實驗時分別將辛伐他汀儲存液用PBS稀釋為1、10及100 μmol/L，加入培養(yǎng)液預孵育細胞2 h，然后加入終濃度為100 μmol/L尼古丁作用24 h。于實驗終點收集各組上清液，1500 r/min離心， -20 ℃保存，待測。

2.3酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測t-PA和PAI-1 分別將t-PA和PAI-1標準品準確復溶，用稀釋液做6次倍比稀釋，t-PA標準品濃度分別為30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375 μg/L；PAI-1標準品濃度分別為120、60、30、15、7.5、3.75、1.875 μg/L。其余步驟嚴格按t-PA和PAI-1測定試劑盒說明書操作。以A490對t-PA和PAI-1的標準品濃度分別在普通坐標系(t-PA)和雙對數(shù)坐標系(PAI-1)上作標準曲線，待測樣品t-PA和PAI-1含量由標準曲線上得出。

2.4RT-PCR檢測t-PA和PAI-1 mRNA 5組細胞孵育完成后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2-3次，加入1 mL Trizol試劑提取細胞總RNA。RNA提取按說明書進行。提取的RNA溶于DEPC-H2O稀釋到1 mL，測定A260/A280值，計算RNA純度及含量，實驗重復3次。取2 μg總RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增t-PA、PAI-1和GAPDA(作為內(nèi)參照)。PCR引物分別為：tPA 上游引物5′-CAAGTCTCCTTCCCCTTTCC-3′，下游引物5′-GGGTTGTGGCAACAGAAAGT-3′，目的片段190 bp；PAI-1上游引物5′-TGCCCTCTACTTCAACGG-3′，下游引物5′-GTCGGTCATTCCCAGGTT-3′，目的片段390 bp。內(nèi)參照GAPDH上游引物5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3′，目的片段307 bp。PCR反應體系為：buffer 5 μL，dNTP 4 μL，目的基因 5 μL，正、反向引物各 1 μL，Taq酶0.5 μL，DEPC-H2O 33.5 μL混勻。PCR反應條件為：94 ℃預變性120s，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共反應32個循環(huán)。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1HUVECs形態(tài)觀察

培養(yǎng)2-3 d 后,倒置相差顯微鏡下可見到細胞由均勻懸浮狀態(tài)變?yōu)榇罅抠N壁生長,形態(tài)由圓形變?yōu)椴灰?guī)則形，呈扁平、橢圓形、梭形或多角形，為單層鵝卵石鑲嵌樣排列，細胞單層融合時呈典型的“鋪路石”樣外觀，見圖1。

Figure 1. Morphology of HUVECs under inverted phase contrast microscope(×100).

圖1倒置顯微鏡下的HUVECs

2不同濃度辛伐他汀對尼古丁誘導HUVECs分泌t-PA和PAI-1的影響

對照組HUVECs釋放少量t-PA和PAI-1。尼古丁刺激后，HUVECs PAI-1分泌增加, 且明顯高于對照組。經(jīng)不同濃度辛伐他汀預處理HUVECs后，其上清液PAI-1含量較尼古丁組降低，且呈濃度依賴性；100 μmol/L辛伐他汀組 PAI-1與對照組無顯著差異。t-PA含量各組間無顯著差異。各組之間的比較見表1。

表1各組HUVECst-PA與PAI-1含量比較

Groupt-PA(μg/L)PAI-1(μg/L)Control1．082±0．13138．660±1．749Nicotine0．725±0．21166．051±2．890?1μmol/Lsimvastatin+nicotine0．836±0．25560．788±2．500?△10μmol/Lsimvastatin+nicotine0．965±0．19654．955±3．971?△100μmol/Lsimvastatin+nicotine1．100±0．27441．924±4．472△

*P<0.05vscontrol；△P<0.05vsnicotine.

3不同濃度辛伐他汀對尼古丁誘導HUVECs表達t-PA和PAI-1mRNA的影響

圖2顯示,參照marker，判斷PCR產(chǎn)物片段大小，并與內(nèi)參照帶的吸光度作比較，求其比值。應用圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描并積分，比較對照組、尼古丁組和不同濃度辛伐他汀組RT-PCR擴增的t-PA/GAPDH和PAI-1/GAPDH目的DNA片段灰度比值，見圖3。圖像分析儀灰度掃描積分比較可見，尼古丁組 HUVECs PAI-1 mRNA 表達較對照組明顯升高，t-PA mRNA表達較對照組明顯降低。不同濃度辛伐他汀組PAI-1 mRNA表達均較尼古丁組降低，t-PA mRNA的表達較尼古丁組升高，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性，以100 μmol/L辛伐他汀組作用最為顯著；100 μmol/L辛伐他汀組 PAI-1 mRNA 與對照組無顯著差異。

Figure 2. Effects of simvastatin on mRNA expression of t-PA and PAI-1 in HUVECs induced by nicotine. M：marker；1：control；2： nicotine；3：1 μmol/L simvastatin+ nicotine；4:10 μmol/L simvastatin+nicotine；5:100 μmol/L simvastatin+ nicotine.

圖2辛伐他汀對尼古丁誘導HUVECs表達t-PA與PAI-1mRNA的影響

討 論

t-PA和PAI-1是纖溶系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，主要由內(nèi)皮細胞合成和分泌。t-PA能與血栓中的纖維蛋白特異性結(jié)合，激活纖溶酶原形成纖溶酶(PA)，降解纖維蛋白而使血栓溶解，還可抑制血小板的聚集。PAI-1是t-PA的快速抑制物，可與t-PA形成1∶1復合物，隱藏t-PA的結(jié)合位點。PAI-1同樣也可結(jié)合于纖維蛋白，保留其對t-PA的抑制作用[2]。 t-PA/PAI-1比值下降可導致血漿纖溶活性降低，有助于纖維蛋白在血管內(nèi)膜沉積，是血栓性疾病發(fā)生的重要預測因子。我們的前期實驗提示，尼古丁可顯著增加HUVECs PAI-1 mRNA及蛋白的表達，導致內(nèi)皮細胞纖溶失衡[3]。辛伐他汀作為一種具有內(nèi)皮保護及抗炎作用的物質(zhì)，是否對尼古丁介導的內(nèi)皮細胞纖溶功能紊亂具有保護作用，目前尚未見報道。

圖3辛伐他汀對尼古丁誘導HUVECst-PA與PAI-1mRNA表達的影響

本實驗采用不同濃度的辛伐他汀干預HUVECs，結(jié)果表明，1、10及100 μmol/L辛伐他汀組PAI-1 mRNA及蛋白表達均較尼古丁組降低，提示辛伐他汀可抑制 HUVECs PAI-1 mRNA表達和蛋白的產(chǎn)生與釋放，對尼古丁介導的內(nèi)皮細胞纖溶損害具有保護作用，與國外類似研究結(jié)果一致[4]。文獻報道，他汀類藥物具有調(diào)脂以外的獨立抗炎作用，而且還可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞分泌細胞因子[5]。PAI-1為一種急性反應性蛋白，其表達是通過PKC依賴途徑，消除炎癥可改善內(nèi)皮的纖溶活性[6,7]。研究證實，辛伐他汀對內(nèi)皮細胞纖溶活性的改善作用是通過抗炎、保護內(nèi)皮細胞，阻斷了細胞骨架介導的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，因此阻斷了該信號轉(zhuǎn)導途徑PAI-1基因的轉(zhuǎn)錄[8]。本文辛伐他汀對尼古丁介導的HUVECs PAI-1 mRNA和蛋白表達的抑制作用可能與阻斷PKC途徑有關，確切機制尚需進一步研究。

本實驗不同濃度辛伐他汀組t-PA mRNA表達均較尼古丁組顯著升高，但各組間t-PA蛋白無顯著差異。這種基因與蛋白表達不一致現(xiàn)象的可能原因有：PAI-1的生理濃度較t-PA高數(shù)十倍，PAI-1與t-PA形成1∶1復活物后滅活了t-PA[9]，使細胞上清液中t-PA含量很少或失活；試劑盒靈敏度低不易檢出等，擬進一步采用其它方法檢測該指標。

總之，血栓性疾病的發(fā)生與PAI-1活性升高，t-PA/PAI-1失衡有關。降低高活性的PAI-1對血栓性疾病的防治起重要作用[10、11]。本研究表明，在體外辛伐他汀可以明顯改善尼古丁介導的HUVECs纖溶活性減低，為進一步研究吸煙所致纖溶功能紊亂的防治提供理論依據(jù)。

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Effectsofsimvastatinonnicotine-inducedt-PAandPAI-1expressioninhumanumbilicalveinendothelialcells

HU Li-juan, HU Xiao-yun, DU Yan, HAN Bao-fen

(DepartmentofRespiratory,TheFirstAffiliatedHospital,ShanxiMedicineUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:huxiaoyunly@sina.com)

AIM: To investigate the effects of simvastatin on nicotine-induced expression of tissue plasminogen activator (t-PA) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) at mRNA and protein levels in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSCultured HUVECs at passage 3 to 6 were randomly divided into control group, nicotine group and simvastatin groups. The cells in simvastatin groups were treated with simvastatin at the concentrations of 1, 10 and 100 μmol/L for 2 h, and then exposed to nicotine at the concentration of 100 μmol/L for 24 h. The production of t-PA and PAI-1 in the cultured medium was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The mRNA expression of t-PA and PAI-1 was determined by reverse transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR).RESULTSCompared with the control cells, the secretion and mRNA expression of PAI-1 in the cells treated with nicotine were significantly increased(P<0.05). Simvastatin decreased the secretion and mRNA expression of PAI-1 in HUVECs stimulated by nicotine in a dose-dependent manner, and the most notable inhibitory effect was observed in 100μmol/L simvastatin group, in which the level of PAI-1 was almost the same as that in the control cells (P>0.05). Compared with the control cells, nicotine inhibited the mRNA expression of t-PA in HUVECs (P<0.05), and simvastatin at the concentrations of 10 and 100 μmol/L markedly increased the mRNA expression of t-PA in HUVECs treated with nicotine. However, the production of t-PA remained no significantly different among groups (P>0.05).CONCLUSIONSimvastatin obviously decreases the expression of PAI-1 at mRNA and protein levels, increases the mRNA expression of t-PA, and improves the fibrinolytic function of HUVECs exposed to nicotineinvitro.

Simvastatin; Nicotine; Human umbilical vein endothelial cells; Tissue plasminogen activator; Plasminogen activator inhibitor 1

R363

A

1000-4718(2011)03-0460-04

2011-10-09

2011-01-05

太原市科技興市資助項目(No.0904051)

△通訊作者 Tel：0351-4639901； E-mail：huxiaoyunly@sina.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.008