諶 容 ，王秋巖，殷曉浦，魏東芝，謝 恬

（1生物醫(yī)藥與健康研究中心，杭州師范大學(xué)，浙江 杭州 310012；2生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237）

進(jìn)展與述評(píng)

醇脫氫酶不對(duì)稱還原制備手性醇的研究進(jìn)展

諶 容1，2，王秋巖1，殷曉浦1，魏東芝2，謝 恬1

（1生物醫(yī)藥與健康研究中心，杭州師范大學(xué)，浙江 杭州 310012；2生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237）

從醇脫氫酶在不對(duì)稱還原制備手性醇化合物的應(yīng)用出發(fā)，進(jìn)行3個(gè)重要方面綜述：酶分子——作為優(yōu)質(zhì)高效的生物催化劑，對(duì)紅球菌屬、乳酸菌屬、賴氏菌屬及嗜熱微生物來(lái)源的天然或重組醇脫氫酶的催化作用進(jìn)行探討；輔酶的再生方法及優(yōu)缺點(diǎn)分析——探索適合于特定催化反應(yīng)的再生方法，以解決大規(guī)模應(yīng)用時(shí)添加昂貴的輔酶帶來(lái)的成本問(wèn)題；體外進(jìn)化技術(shù)——對(duì)目的酶活性、立體選擇性與穩(wěn)定性的提高。最終為酶催化制備醫(yī)藥及精細(xì)化工品中間體建立一條綠色高效經(jīng)濟(jì)的途徑。

醇脫氫酶；手性中間體；輔酶再生；體外進(jìn)化

近年來(lái)，隨著光學(xué)異構(gòu)體藥物藥理作用研究的深入，以及對(duì)消旋藥物申報(bào)和使用的限制，手性藥物的研究和開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為國(guó)際新藥研究的熱點(diǎn)和方向[1]。手性是影響許多藥物安全性和有效性的關(guān)鍵因素，研究藥物及藥物中間體的單一對(duì)映異構(gòu)體合成越來(lái)越重要。單一對(duì)映異構(gòu)體藥物可以通過(guò)化學(xué)或者生物酶法合成。化學(xué)合成的難點(diǎn)在于昂貴的手性催化劑、對(duì)映體的分離純化等。生物酶法合成具有高度立體異構(gòu)選擇性和對(duì)映體過(guò)量的優(yōu)點(diǎn)可以彌補(bǔ)化學(xué)合成的缺陷，另外酶催化具有反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少、光學(xué)純度高及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。因此，酶法合成手性化合物越來(lái)越受到重視[2]。

醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）廣泛存在于各種微生物中，催化醇和醛或酮之間的相互轉(zhuǎn)換，有廣泛的底物特異性，同時(shí)在微生物的生理過(guò)程中起著重要的作用。根據(jù)醇脫氫酶分子長(zhǎng)度和含金屬離子性質(zhì)分為3大類，typeⅠADH 的氨基酸長(zhǎng)度在350個(gè)以上，zinc離子作為催化位點(diǎn)；typeⅡADH的氨基酸長(zhǎng)度在250個(gè)左右，不需要金屬離子的輔助，屬于酮還原酶家族。TypeⅢ ADH需金屬離子激活，在微生物的代謝中起著重要作用[3]。已報(bào)道，多種微生物來(lái)源的醇脫氫酶能將前手性酮、酮酸或酮酯還原成手性醇或手性羥基酸，而帶手性羥基的化合物在藥物中間體合成上有著廣泛的應(yīng)用[4]。來(lái)自馬肝、紅平紅球菌、Lactobacillus brevis、Thermobacterium brockii、面包酵母的醇脫氫酶已不同程度的商業(yè)化。本文綜述了近年來(lái)幾種重要的醇脫氫酶在制備手性藥物中間體的應(yīng)用，采用醇脫氫酶催化生物轉(zhuǎn)化時(shí)存在的輔酶再生的解決方案以及體外定向進(jìn)化技術(shù)在醇脫氫酶性質(zhì)改造上的應(yīng)用。

1 微生物來(lái)源的醇脫氫酶及其催化的反應(yīng)

1.1 紅球菌屬的醇脫氫酶

紅平紅球菌Rhodococcus erythropolis來(lái)源的醇脫氫酶（ReADH）是NAD（H）依賴型，屬于含鋅離子的中鏈ADH亞家族，同源四聚體，每個(gè)亞基分子量為36 kD，此酶已商業(yè)化[5]。ReADH有寬的底物特異性，對(duì)脂肪族和芳香族酮及β-酮酯都有較高的活性（表1）[6]。ReADH用于合成手性醫(yī)藥中間體，如合成抗HIV的蛋白酶抑制劑阿扎那韋的中間體（1S,2R）-3-氯-2-羥基-1-（苯甲基）丙基氨基甲酸，ReADH催化前手性酮還原生成（1S,2R）-醇，產(chǎn)量大于90%，非對(duì)映體純度大于98%，對(duì)映體過(guò)量達(dá)到 99.4%[7]。Pollard等[8]應(yīng)用此酶還原微溶于水的 3,5-雙三氟甲基苯乙酮，生成（S）-3,5-雙三氟甲基苯乙醇，轉(zhuǎn)化率＞98%和e.e.＞99.9%，在最佳反應(yīng)條件下，底物濃度可達(dá)到了580 mmol/L，且產(chǎn)物極易分離，分離率＞90%，產(chǎn)率達(dá)到 260 g/(L?d)，產(chǎn)物（S）-3,5-雙三氟甲基苯乙醇是合成NK-1受體拮抗劑的重要手性醇中間體。ReADH能還原帶龐大側(cè)鏈的6-溴-β-四氫萘酮生成（S）-溴-β-四氫萘酚，能達(dá)到e.e.＞99%，后者可用于合成抗心率失常候選藥MK-0499[9]。ReADH還原苯基丙酮生成相應(yīng)的（S）-2-羥基-苯丙醇，后者是一種膽汁固體成分分泌促進(jìn)劑。（S）-2-羥基-苯丙醇也是合成苯異丙胺的中間體，是抗高血壓、鎮(zhèn)痙劑或抗癲癇藥物的前體[10]。

表1 Rhodococcus erythropolis的醇脫氫酶催化合成的手性醇

盡管ReADH具有寬的底物選擇性及高度的立體異構(gòu)性，但仍存在一些缺點(diǎn)，如全細(xì)胞催化時(shí)立體選擇性較低，使用純化酶作催化劑時(shí)立體選擇性較好，可達(dá)e.e.＞99%，且不隨著反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)體系變大而降低，但異源表達(dá)量時(shí)可溶性酶量較低，多以包涵體形式存在[6]。因此，對(duì)重組 ReADH可溶性表達(dá)的進(jìn)一步研究將拓寬其在不對(duì)稱還原中的應(yīng)用。

1.2 乳酸菌屬的醇脫氫酶

研究較多的有來(lái)自Lactobacillus brevis和Lactobacillus kefir的醇脫氫酶。L. brevis醇脫氫酶（LbADH）是短鏈的氧化還原酶超家族的一員，同源四聚體，每個(gè)單體的分子量是26.6 kD，輔助因子是NADPH[11]。LbADH具有高度的立體專一性和對(duì)映體選擇性，可以還原帶有龐大側(cè)鏈的酮和酮酸衍生物、β，δ-二酮基酯類和環(huán)形酮等，生成相應(yīng)的（R）-醇和（R）-羥基酸酯，且e.e. ＞99%；具有獨(dú)特的鹵代苯乙酮還原活性，且活性較高[12]。Schroer等[13]建立了雙膜反應(yīng)工藝，LbADH還原2,5-已二酮生成（2R,5R）-己二醇，同時(shí)氧化 NAD(P)H生成NAD(P)+，反應(yīng)體系中加入異丙醇實(shí)現(xiàn)NAD(P)H的再生，產(chǎn)率達(dá)到＞170 g/(L?d)，（2R,5R）-己二醇用于合成手性磷配體。值得一提的是LbADH能還原甲基-β-萘基甲酮生成相應(yīng)的（R）-醇，且 e.e.＞ 99%。LbADH對(duì)甲基-β-萘基甲酮的高活性，說(shuō)明該酶對(duì)側(cè)鏈龐大的酮類化合物的還原能力非常強(qiáng)，故開(kāi)展 LbADH在綠色化學(xué)合成上的應(yīng)用具有重要的意義。

L. kefir的醇脫氫酶（LkADH）由759 bp核苷酸組成，編碼 252個(gè)氨基酸，屬于短鏈脫氫酶，NADPH依賴型。在大腸桿菌中重組表達(dá)的LkADH能夠還原多種脂肪族、芳香族、環(huán)形的酮及β-酮酯，生成相應(yīng)的（R）-醇[14-15]。Bradshaw等[16]研究大腸桿菌重組的 LkADH具有很寬的底物特異性，催化多種類型的底物還原反應(yīng)生成相應(yīng)的帶芳香族的、環(huán)形的、多環(huán)的和脂肪族側(cè)鏈的手性醇，具有較高的產(chǎn)率和高度的對(duì)映體過(guò)量（94%～99%）。利用L. kefir全細(xì)胞催化，細(xì)胞內(nèi)的醇脫氫酶首先還原 6-氯-3,5-二氧代己酸叔丁酯的C3的酮基形成R構(gòu)型的手性羥基，進(jìn)一步還原C5位酮基形成S構(gòu)型的手性羥基，一鍋法合成6-氯-(3R,5S)-二羥基己酸叔丁酯，在22 h反應(yīng)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)率為47.5%和e.e.＞99%，(3R,5S)-二羥基己酸叔丁酯為多種HMG-CoA還原酶抑制劑的合成提供手性側(cè)鏈（圖1）[17]。

圖1 L. kefir 全細(xì)胞催化一鍋法合成6-氯-(3R,5S)-二羥基己酸叔丁酯

固定化細(xì)胞技術(shù)（immobilized cells）是將微生物細(xì)胞直接作為酶原，進(jìn)行催化反應(yīng)，具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，如節(jié)省了酶分離純化的時(shí)間和成本，多酶促反應(yīng)，增加酶的穩(wěn)定性等。Tan等[18]利用固定化的L. kefir全細(xì)胞催化2,5-己二酮的還原生成（5R）-羥基己烷-2-酮，e.e.＞99%，在活塞流反應(yīng)器中收率達(dá)87 g/(L?d)，6天后仍保持68%的殘余活性。采用固定化細(xì)胞技術(shù)節(jié)約酶成本，具有應(yīng)用的潛力和價(jià)值。

1.3 賴氏菌屬的醇脫氫酶

賴氏菌屬的Leifsoniasp.是Inoue等從苯乙烯同化后的土壤樣本，對(duì)約900株菌株進(jìn)行篩選所獲得的能將前手性酮還原生成（S）-1-三氟苯乙醇的菌株。（S）-1-三氟苯乙醇是重要的醫(yī)藥中間體[19]。LeifsoniaADH的分子量是110 kD，同源四聚體，輔助因子是NADH。LeifsoniaADH可還原一系列的醛和酮，如：氯丙酮、2-庚酮、2-辛酮等前手性酮，對(duì)鹵代的苯乙酮、甲氧苯乙酮、苯丁酮、環(huán)戊酮等有一定的活性，對(duì)酮酯如甲基丙酮酸、氧代丁酸鹽等也有較高的活性（表2）。LeifsoniaADH催化反應(yīng)具有高度的立體選擇性，三氟苯乙酮還原成(S)-1-三氟苯乙醇，對(duì)映體過(guò)量大于99%，且反應(yīng)體系中加入異丙醇即可實(shí)現(xiàn) NADH的再生。LeifsoniaADH還原苯乙酮、雙乙?；?、長(zhǎng)鏈烷基酮等生成(R)-醇，且 e.e.＞99%，有的底物轉(zhuǎn)化率甚至高達(dá)100%[20-21]。帶手性羥基的苯乙酮可在苯環(huán)的不同位置上進(jìn)行鹵代或氨基取代，產(chǎn)物可作為手性配體和醫(yī)藥中間體用于不對(duì)稱合成，如用于合成擬腎上腺素藥，抗生素，HIV-逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑等。

1.4 嗜熱微生物的醇脫氫酶

酶的穩(wěn)定性，特別是耐有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，在工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用中起著十分重要的作用。嗜熱微生物來(lái)源的酶具有很高的熱穩(wěn)定性，而熱穩(wěn)定性與有機(jī)溶劑等變性劑條件下的穩(wěn)定性是正相關(guān)的，因此嗜熱微生物來(lái)源的醇脫氫酶吸引了眾多研究者的目光[22]。

表2 Leifsonia sp. ADH的催化反應(yīng)

超高溫古細(xì)菌Sulfolobus solfataricus的NADH依賴的醇脫氫酶，屬于中鏈ADH家族。其底物譜很寬，包括線性和分支的伯醇，線性和環(huán)狀的仲醇和酮，并且在較高的溫度（＞95 ℃）仍具有活性，其高度的熱穩(wěn)定性在應(yīng)用中具有很大的潛在價(jià)值[23]。超高溫古細(xì)菌Pyrococcus furiosus的醇脫氫酶以單體存在，分子量為32 kD，在100 ℃仍有較好的活性和穩(wěn)定性，對(duì)雙乙酰基酮具有很好的還原能力[24]。雙乙?；倪€原可以生成兩個(gè)手性碳原子的結(jié)構(gòu)，此產(chǎn)物可用于降血脂類他汀藥物的手性側(cè)鏈的合成。

嗜熱微生物來(lái)源的醇脫氫酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性，在生物催化中具有較大的應(yīng)用價(jià)值[25]。嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌Thermoanaerobacter ethanolicus的仲醇脫氫酶有很高的熱穩(wěn)定性，在90℃時(shí)活性最好且半衰期為1.7 h，有機(jī)溶劑穩(wěn)定性非常高，如在 100%的十二烷、正辛烷、甲苯和吡啶溶液中溫?。?0 ℃）3 h后活性仍分別保持90%、100%、80%和68%[26]。此酶的立體選擇性與反應(yīng)溫度有關(guān)，如反應(yīng)溫度在26 ℃下對(duì)（R）-2-丁醇的氧化具有更高的催化效率；26 ℃以上時(shí)，則對(duì)（S）-2-丁醇的氧化效率較高[27]。極端嗜熱菌Thermus thermophilus的短鏈ADH能夠還原苯乙酮、2,2,2-三氟苯乙酮、四氫萘酮、α-甲基/乙基苯甲酰甲酸分別形成相應(yīng)的（S）-苯乙醇（e.e.＞99%）、（R）-2,2,2-三氟苯乙醇（e.e.約 93%）、（S）-四氫萘酚（e.e.＞99%）、甲基（R）-扁桃酸鹽（e.e.約92%）和乙基（R）-扁桃酸鹽（e.e.約95%），這些化合物都是重要的醫(yī)藥中間體[28]。棲熱菌Thermussp. ATN1的醇脫氫酶，能還原 2-戊酮、2-庚酮、芐基丙酮，苯丙酮生成（S）-2-戊醇、（S）-2-庚醇、（S）-4-苯基-2-丁醇和（S）-1-苯基-2-丙醇，且e.e.＞99%。反應(yīng)體系應(yīng)用水-有機(jī)溶劑兩相反應(yīng)，均有活性，有機(jī)溶劑對(duì)酶活性影響不大，說(shuō)明其耐有機(jī)溶劑穩(wěn)定性很強(qiáng)[29]。

1.5 其它菌屬的醇脫氫酶

除了上述幾種研究和應(yīng)用較多的醇脫氫酶，粗糙脈孢菌Neurospora crassa的ADH還原相應(yīng)的底物生成（4S，6S）-5,6-二氫-4-羥基-6-甲基-4氫-噻吩并噻喃-7,7 二氧化物，后者是治療青光眼藥物trusopt 的中間體[30]。結(jié)合酵母Zygosaccharomyces rouxii的ADH可以還原3,4-亞甲二氧基苯基丙酮生成（S）-3,4-亞甲二氧基苯基丙醇，且產(chǎn)率＞95%和e.e. ＞99.9%、總體上反應(yīng)器的產(chǎn)率為75 g/(L?d)，此產(chǎn)物是合成苯重氮基鹽的重要中間體，而苯重氮基鹽是重要的鎮(zhèn)定安眠，抗焦慮藥物[31]。Patel等[32-33]利用面包酵母的醇還原酶合成重要的手性藥物中間體（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，后者是 HGM-CoA還原酶抑制劑和β-1，4-二氫吡啶類鈣離子通道阻斷劑等藥物，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。面包酵母對(duì)雜環(huán)類化合物如4-乙酰吡啶、苯環(huán)及苯環(huán)衍生物等前手性酮均具有 100%的轉(zhuǎn)化率和不同程度的立體異構(gòu)選擇性[34]。畢赤酵母的仲醇脫氫酶在大腸桿菌重組表達(dá)，能還原乙基 4-氯乙酰乙酸鹽生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸，產(chǎn)率為98.5%及99%對(duì)映體過(guò)量，同時(shí)表達(dá)Mycobacteriumsp. 來(lái)源的甲酸脫氫酶進(jìn)行NADH的再生，實(shí)現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)境友好的生產(chǎn)方式[35]。

多種微生物來(lái)源的醇脫氫酶已經(jīng)被分離，且部分醇脫氫酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)及酶學(xué)性質(zhì)已經(jīng)被鑒定，但醇脫氫酶是包含眾多成員的超家族，其亞家族中各種類型的醇脫氫酶如長(zhǎng)鏈、中鏈、和短鏈醇脫氫酶均具有不對(duì)稱催化的可能（表3）。因此，若分別研究不同微生物來(lái)源醇脫氫酶的性質(zhì)與功能，這無(wú)疑是一項(xiàng)耗時(shí)且工作量巨大的任務(wù)；且目前的研究對(duì)象為可培養(yǎng)微生物來(lái)源，不足環(huán)境微生物總量的1%，目前已有的研究無(wú)疑是非常小的一部分。因此，建立高效的醇脫氫酶篩選方法從整個(gè)環(huán)境微生物中快速分離到目的酶尤其重要。

2 輔酶再生系統(tǒng)

NAD(P) 依賴的氧化還原酶的活性依賴于NAD(P)H/ NAD(P)+，這些輔助因子價(jià)格昂貴，且穩(wěn)定性受溫度和pH值的影響，使其在工業(yè)使用上受到了限制，研究有效的輔助因子再生系統(tǒng)有重要的意義。輔酶再生是輔酶在氧化態(tài)和還原態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，可通過(guò)底物耦聯(lián)法和酶耦聯(lián)法來(lái)實(shí)現(xiàn)。輔酶再生系統(tǒng)的研究主要包括了 NAD(P)H的酶法再生、NAD(P)+的酶法再生、電化學(xué)再生和全細(xì)胞催化體系中輔酶的再生等[36]。輔酶再生的方法各有優(yōu)劣（表4），選擇的策略主要是酶在有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性、酶的活性、底物和產(chǎn)物對(duì)酶或細(xì)胞的影響。

目前，使用最多的是脫氫酶對(duì)NADH的再生[37]，如Pfizer公司使用表皮葡萄球菌來(lái)源的（R）-乳酸-NAD氧化還原酶與來(lái)自Candida boidinii的甲酸脫氫酶聯(lián)合酶催化在工業(yè)級(jí)規(guī)模級(jí)別上實(shí)現(xiàn)了（R）-3-（4-氟苯基）-2-羥基丙酸的生產(chǎn)[38]。經(jīng)濟(jì)、高活性且穩(wěn)定的葡萄糖脫氫酶或6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化的NAD（P）H再生系統(tǒng)已有報(bào)道[39]。亞磷酸脫氫酶也可用于NAD（P）的再生，但其高磷廢物的產(chǎn)生和反應(yīng)體系依賴pH值的劣勢(shì)限制了其應(yīng)用[40]。Lopez de Felipe等[41]在L. lactis中表達(dá)了NADH氧化酶，將NADH脫氫氧化生成NAD+，從而實(shí)現(xiàn)了NAD+的再生。電化學(xué)法不需要酶和底物，因此不會(huì)有產(chǎn)物和副產(chǎn)物，具有清潔、可持續(xù)的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是有力的綠色技術(shù)。如銠復(fù)合物與Thermussp.來(lái)源的醇脫氫酶在有機(jī)/水兩相反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)NADH的再生，獲得（1S，3S）-3-甲基環(huán)戊醇，為電化學(xué)法在有機(jī)合成應(yīng)用中提供了有力的證據(jù)[42]；錫氧化物電極在多種反應(yīng)條件下都可用于 NADH的氧化和NAD+的還原。Kim等[43]使用醇脫氫酶氧化異丙醇生成丙酮，同時(shí)還原NAD+生成NADH，錫氧化物電極再將NADH氧化成NAD+，從而實(shí)現(xiàn)

了NAD+的循環(huán)，此電化學(xué)方法對(duì)NADP+的循環(huán)再生同樣具有高效的作用。光化學(xué)法依賴光合細(xì)菌實(shí)現(xiàn)輔酶因子的再生循環(huán)，但效率低[44]。醇脫氫酶不僅可以催化底物向目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，同時(shí)也可用于輔助因子的還原，從而實(shí)現(xiàn)單酶在同一個(gè)反應(yīng)體系中起兩種作用[45]。氫化酶可還原H2，同時(shí)實(shí)現(xiàn)NAD（P）的循環(huán)再生，但H2的易燃性是整個(gè)反應(yīng)存在不安全的因素[46]。因此，選擇合適的輔酶再生系統(tǒng)是醇脫氫酶催化反應(yīng)的重要因素，通過(guò)再生循環(huán)的建立，可實(shí)現(xiàn)輔助因子經(jīng)濟(jì)有效的再生。

表3 上述幾種微生物來(lái)源的醇脫氫酶性質(zhì)特性

表4 輔酶再生方法

3 酶的體外進(jìn)化

酶作為生物催化劑其專一性和高效性是一般催化劑所不能比擬的，且具有環(huán)境友好性的優(yōu)勢(shì)。但是天然酶的許多性質(zhì)，如較差的選擇性、不穩(wěn)定性以及苛刻的酶促反應(yīng)條件，使其不適應(yīng)工業(yè)大規(guī)模應(yīng)用，因此對(duì)酶進(jìn)行定向進(jìn)化研究成為根據(jù)實(shí)際需要改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的有效途徑[47-48]。

對(duì)醇脫氫酶的體外進(jìn)化，主要包括提高酶對(duì)底物的活力、增加底物特異性、提高有機(jī)溶劑穩(wěn)定性、降低對(duì)輔基的作用和改變輔酶親和力。通過(guò)易錯(cuò)PCR構(gòu)建超高溫古生菌Pyrococcus furiosus醇脫氫酶的突變庫(kù)，獲得在常溫條件下還原2,5-己二酮生成（2S,5S）-己二醇的突變體，其活力提高至野生菌的 10倍[49]。通過(guò)理性設(shè)計(jì)嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的仲醇脫氫酶，獲得單氨基酸突變的菌株（I86A），此突變株的活性位點(diǎn)比野生型能容納更大的空間位阻取代基，而且產(chǎn)物的立體化學(xué)選擇是按照anti-Prelog的構(gòu)型模式進(jìn)行的[50]。W110A 突變株能還原相應(yīng)的酮生成（S）-1-苯基-2-丙醇、（S）-4-苯基-2-丁醇，且e.e.＞99%，而其野生型無(wú)活性[51]。對(duì)來(lái)源于Rhodococcussp. ST-10的苯乙醛還原酶（一種中鏈的醇脫氫酶）進(jìn)行易錯(cuò)PCR建立隨機(jī)突變文庫(kù)，篩選獲得了以異丙醇作為底物進(jìn)行NADH的再生的突變株，建立了單酶催化兩個(gè)反應(yīng)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及輔酶的再生循環(huán)[45]。某些醇脫氫酶反應(yīng)體系中需要一些金屬離子作用，基于易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變文庫(kù)篩選不受Mg2+等離子限制的醇脫氫酶有利于更好的應(yīng)用[52]。L. brevis的醇脫氫酶依賴NADP(H)，對(duì) NAD(H)的依賴較小。但NADP(H)比 NAD(H)昂貴且不穩(wěn)定，因此Machielsen 等對(duì)其進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)以構(gòu)建突變文庫(kù)，獲得相對(duì)野生菌活性高4倍的突變菌株（對(duì)NADH的親和力），此突變菌株（R38P）已證明具有更有用的藥物前體合成作用[53]。酶的定向進(jìn)化是用于解決酶工程中重大問(wèn)題的關(guān)鍵技術(shù)，使酶的催化性能達(dá)到和接近工業(yè)用途的要求逐漸成為可能。

盡管科研工作者在使用易錯(cuò) PCR技術(shù)或定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了酶學(xué)性質(zhì)改進(jìn)的突變株，但是此技術(shù)工作量大及消耗時(shí)間長(zhǎng)，且得到的突變株活性提高程度有限。本課題組成員利用傳統(tǒng)的活性篩選方法從宏基因組文庫(kù)中篩選到新酶，并以此為模板設(shè)計(jì)引物采用改進(jìn)的PCR技術(shù)釣取大量的同源序列，結(jié)合 gene shuffling獲得了具有活性的多條基因序列，為根據(jù)需要而快速、有效地篩選或改進(jìn)酶學(xué)性質(zhì)發(fā)揮了重要的作用，該成果發(fā)表在Journal of Biological Chemistry雜志[54]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

在工業(yè)級(jí)生物催化應(yīng)用中占主導(dǎo)地位的是氧化還原酶（30%），僅次于水解酶（44%）。醇脫氫酶正是重要的一種氧化還原酶。盡管醇脫氫酶在醫(yī)藥、精細(xì)化工和環(huán)境保護(hù)等行業(yè)中的巨大作用，但其實(shí)際應(yīng)用絕大多數(shù)仍處在實(shí)驗(yàn)室階段，要盡快實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用，需要解決以下問(wèn)題。

（1）盡管有多種微生物來(lái)源的酶被分離并鑒定，但是可培養(yǎng)微生物不足微生物總數(shù)的 1%。因此開(kāi)展各種生境環(huán)境中未培養(yǎng)微生物來(lái)源的酶的分離與鑒定，無(wú)疑會(huì)為生物催化的重要元素即酶提供大量的來(lái)源，從而有更高的概率篩選到更適合工業(yè)化應(yīng)用的“理想”酶。本課題組成員從宏基因組出發(fā)，采用基于序列篩選的方法獲得新酶，使酶的來(lái)源突破了傳統(tǒng)的可培養(yǎng)微生物的局限[55]。

（2）利用體外重組制備醇脫氫酶成本高，而全細(xì)胞催化又受制于底物利用率及細(xì)胞毒性的問(wèn)題。

（3）由于大多數(shù)底物是有機(jī)試劑，微溶于水或不溶于水，導(dǎo)致反應(yīng)體系中底物利用率低，且酶的穩(wěn)定性降低。

（4）輔助因子的添加從而增加反應(yīng)的成本[56]。

針對(duì)上述問(wèn)題，獲得高穩(wěn)定性的酶并解決反應(yīng)體系中輔酶再生循環(huán)這兩方面顯得尤其重要。同時(shí)，從重組酶和基因工程菌兩方面著手解決醇脫氫酶在工業(yè)化應(yīng)用中的難點(diǎn)，將會(huì)大大加快其應(yīng)用。更重要的是，近幾年發(fā)展的非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)和酶及細(xì)胞的固定化技術(shù)將會(huì)提高酶的工業(yè)化應(yīng)用[57]，為實(shí)現(xiàn)其合成醫(yī)藥中間體的大規(guī)模轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

[1]FDA’s policy statement for the development of new stereoisomeric drugs [J].Chirality，1992，4（5）：338-340.

[2]Goldberg K，Schroer K，Lütz S，et al. Biocatalytic ketone reduction—a powerful tool for the production of chiral alcohols—partⅠ：Processes with isolated enzymes[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，2007，76（2）：249-255.

[3]Radianingtyas H，Wright P C. Alcohol dehydrogenases from thermophilic and hyperthermophilic archaea and bacteria[J].FEMS Microbiol. Rev.，2003，27（5）：593-616.

[4]Patel R N. Biocatalytic synthesis of chiral intermediates[J].Food Technol. Biotechnol.，2004，42（4）：305-325.

[5]Abokitse K，Hummel W. Cloning，sequence analysis，and heterologous expression of the gene encoding a（S）-specific alcohol dehydrogenase fromRhodococcus erythropolisDSM 43297[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，2003，62：380-386.

[6]Hummel W，AbokitseK，Drauz K，et al. Towards a large-scale asymmetric reduction process with isolated enzymes：Expression of an（S）-alcohol dehydrogenase inE. coliand studies on the synthetic potential of this biocatalyst[J].Adv. Synth. Catal.，2003，345：153-159.

[7]Patel R，Chu L，Mueller R. Diastereoselective microbial reduction of（S）-[3-chloro-2-oxo-1-（phenylmethyl）propyl]carbamic acid，1,1-dimethylethyl ester[J].Tetrahedron：Asymmetry，2003，14（20）：3105-3109.

[8]Pollard D，Truppo M，Pollard J，et al.Effective synthesis of（S）-3,5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymatic reduction[J].Tetrahedron：Asymmetry，2006，17：554-559.

[9]Hussain W，Pollard D J，Truppo M，et al. Enzymatic ketone reductions withco-factor recycling：Improved reactions with ionic liquidco-solvents[J].J. Mol. Catal. B：Enzym.，2008，55：19-29.

[10]Liese A，Seelbach K，Wandry C. Industrial Biotransformations[M]. New York：Wiley-VCH，2000：423.

[11]Niefind K，Müller J，Riebel B，et al. The crystal structure of R-specific alcohol dehydrogenase fromLactobacillus brevissuggests the structural basis of metal dependency[J].J. Mol. Biol.，2003，327：317-328.

[12]Wolberg M，Hummel W，Müller M. Biocatalytic reduction of b,ddiketo esters：A highly stereoselective approach to all four stereoisomers of a chlorinated b,d-dihydroxy hexanoate[J].Chem. Eur. J.，2001，7：4562-4571.

[13]Schroer K，Lutz S. A continuously operated bimembrane reactor process for the biocatalytic production of（2R，5R）-hexanediol[J].Org. Process Res. Dev.，2009，13：1202-1205.

[14]Weckbecker A，Hummel W. Cloning，expression，and characterization of an（R）-specific alcohol dehydrogenase fromLactobacillus kefir[J].Biocatal. Biotransform.，2006，24（5）：380-389.

[15]Humme1 W. Reduction of acetophenone to R（+）-phenylethanol by a new alcohol dehydrogenase fromLactobacillus kefir[J].Appl. Microbio. Biotechnol.，1990，34（1）：15-19.

[16]Bradshaw C W，Humme1 W，Wong C H.Lactobacillus kefiralcohol dehydrogenase：A useful catalyst for synthesis[J].J. Org. Chem.，1992，57（5）：1552-1556.

[17]Pfruender H，Amidjojo M，Hang F，et al. Production ofLactobacillus kefircells for asymmetric synthesis of a 3，5-dihydroxycarboxylate[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，2005，67：619-622.

[18]Tan AW I，F(xiàn)ischbach M，Huebner H，et al.Synthesis of enantiopure（5R）-hydroxyhexane-2-one with immobilised whole cells ofLactobacillus kefiri[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，2006，71：289-293.

[19]Inoue K，Makino Y，Itoh N. Purification and characterization of a novel alcohol dehydrogenase fromleifsoniasp. strain s749：A promising biocatalyst for an asymmetric hydrogen transfer bioreduction[J].Appl. Environ. Microbiol.，2005，71（7）：3633-3641.

[20]Inoue K，Makino Y，Dairi T，et al. Gene cloning and expression of leifsonia alcohol dehydrogenase（lsadh）involved in asymmetric hydrogen-transfer bioreduction to produce（R）-form chiral alcohols[J].Biosci. Biotechnol. Biochem.，2006，70（2）：418-426.

[21]Inoue K，Makino Y，Itoh N. Production of（R）-chiral alcohols by a hydrogen-transfer bioreduction with NADH-dependentLeifsoniaalcohol dehydrogenase（LSADH）[J].Tetrahedron：Asymmetry，2005，16：2539-2549.

[22]Burton S G，Cowan D A，Woodley J M. The search for the ideal biocatalyst[J].Nat. Biotechnol.，2002，20：37-45.

[23]Rella R，Raia C A，Pensa M. A novel archaebacterial NAD+-dependent alcohol dehydrogenase[J].Purification and Properties. Eur. J. Biochem.，1987，167：475-479.

[24]Machielsen R，Uria A R，Servé W M，et al. Production and characterization of a thermostable alcohol dehydrogenase that belongs to the aldo-keto reductase superfamily[J].Appl. Environ. Microbiol.，2006，72（1）：233-238.

[25]Wolberg M，F(xiàn)ilho M V，Bode S. Chemoenzymatic synthesis of the chiral side-chain of statins：Application of an alcohol dehydrogenase catalysed ketone reduction on a large scale[J].Bioprocess Biosyst. Eng.，2008，31（3）：183-191.

[26]Miroliaei M，Nemat-Gorgani M. Effect of organic solvents on stability and activity of two related alcohol dehydrogenases：A comparative study[J].Int. J. Biochem. Cell Biol.，2002，34：169-175.

[27]Pham Van T，Phillips R S. Effects of substrate structure and temperature on the stereospecificity of secondary alcohol dehydrogenase from thermoanaerobacter ethanolicus[J].J. Am. Chem. Soc.，1990，112：3629-3632.

[28]Pennacchio A，Pucci B，Secundo F. Purification and characterization of a novel recombinant highly enantioselective short-chain NAD(H)-dependent alcohol dehydrogenase fromThermus thermophilus[J].Appl. Environ. Microbiol.，2008，74（13）：3949-3958.

[29]Hollrigl V，Hollmann F，Kleeb A C. TADH，the thermostable alcohol dehydrogenase fromThermussp. ATN1：A versatile new biocatalyst for organic synthesis[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，2008，81（2）：263-273.

[30]Blacklock T J，Sohar P，Butcher J W，et al. An enantioselective synthesis of the topically-active carbonic anhydrase inhibitor MK-0507：5,6-dihydro-（S）-4-（ethylamino）-（S）-6-mehtyl-4H-thieno[2,3-beta]thiopyran-2-sulfonamide 7,7-dioxide hydrochloride[J].J. Org. Chem.，1993，58：1672-1679.

[31]Vicenzi J T，Zmijewski M J，Reinhard M R，et al.Large-scale stereoselective enzymatic ketone reduction within-situproduct removalviapolymeric adsorbent resins[J].Enzyme Microb. Technol.，1997，20：494-499.

[32]Yasohara Y，Kizaki N，Hasegawa J. Synthesis of optically active ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，1999，51（6）：847-851.

[33]Lüdeke S，Richter M，Müller M. Stereoselective synthesis of three iso-mers of tert-butyl 5-hydroxy-4-methyl-3-oxohexanoate through alcohol dehydrogenase-catalyzed dynamic kinetic resolution[J].Adv. Synth. Catal.，2009，351：253-259.

[34]Bawa R A，Ajjabou F，Shalfooh E. Enzymatic reduction of ketones to optically active secondary alcohols[J].Journal of Physical Science，2008，19（2）：1-5.

[35]Matsuyama A，Yamamoto H，Kobayashi Y. Practical application of recombinant whole-cell biocatalysts for the manufacturing of pharmaceutical intermediates such as chiral alcohols[J].Org. Proc. Res. Dev.，2002，6（4）：558-561.

[36]van der Donk W A，Zhao H. Recent developments in pyridine nucleotide regeneration[J].Curr. Opin. Biotechnol.，2003，14：421-426.

[37]Tishkov V I，Popov V O . Protein engineering of formate dehydrogenase [J].Biomol. Eng.，2006，23：89-110.

[38]Tao J H，Org McGee K. Development of a continuous enzymatic process for the preparation of（R）-3-（4-fluorophenyl）-2-hydroxy propionic acid[J].Process Res. Dev.，2002，6：520-524.

[39]Weckbecker A，Hummel W. Glucose dehydrogenase for the regeneration of NADPH and NADH[M]. In：Barredo JL（ed）Microbial Enzymes and Biotransformations. Humana，Totowa，NJ，2005：225-238.

[40]Johannes T W，Woodyer R D，Zhao H. Efficient regeneration of NADPH using an engineered phosphite dehydrogenase[J].Biotechnol. Bioeng.，2007，96（1）：18-26.

[41]Lopez de Felipe F，Kleerebezem M，de Vos W M，et al. cofactor engineering：A novel approach to metabolic engineering inLactococcus lactisby controlled expression of NADH oxidase[J].J. Bacteriol.，1998，180（15）：3804-3808.

[42]lrigl V H，Otto K，Schmid A. Electroenzymatic asymmetric reduction of rac-3-methylcyclo-hexanone to（1S，3S）-3-methylcyclohexanol in organic/aqueous media catalyzed by a thermophilic alcohol dehydrogenase[J].Adv. Synth. Catal.，2007，349，1337-1340.

[43]Kim Y H ，Yoo Y J. Regeneration of the nicotinamide cofactor using a mediator-free electrochemical method with a tin oxide electrode[J].Enzyme Microb. Technol.，2009，44：129-134.

[44]Willner I，Mandler D. Enzyme-catalysed biotransformations through photochemical regeneration of nicotinamide cofactors[J].Enzyme Microb. Technol.，1989，11（8）：467-483.

[45]Makino Y，Dairi T，Itoh N. Engineering the phenylacetaldehyde reductase mutant for improved substrate conversion in the presence of concentrated 2-propanol[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，2007，77：833-843.

[46]Kroutil W，Mang H，Edegger K，et al. Recent advances in the biocatalytic reduction of ketones and oxidation of sec-alcohols[J].Curr. Opin. Chem. Biol.，2004，8（2）：120-126 .

[47]蔣本國(guó)，范圣第，劉寶全. 酶的定向進(jìn)化[J]. 化學(xué)通報(bào)，2004，67（5）：394.

[48]B?ttcher D，Bornscheuer U T. Protein engineering of microbial enzymes[J].Curr. Opin. Microbio.，2010，13：1-9.

[49]Machielsen R，Leferink N G，Hendriks A，et al. Laboratory evolution ofPyrococcus furiosusalcohol dehydrogenase to improve the production of（2S，5S）-hexanediol at moderate temperatures[J]. Extremophiles，2008，12（4）：587-594.

[50]Musa M，Lott N，Laivenieks M，et al. A single point mutation reverses the enantiopreference of thermoanaerobacter ethanolicus secondary alcohol dehydrogenase[J].Chem. Cat. Chem.，2009，1：89-93.

[51]Ziegelmann-Fjeld K I，Musa M M，Phillips R S，et al. Thermoanaerobacter ethanolicus secondary alcohol dehydrogenase mutant derivative highly active and stereoselective on phenylacetone and benzylacetone[J].Protein Engineering，Design & Selection，2007，20（2）：47-55.

[52]Ho K K，Hurley T D，Weiner H. Selective alteration of the rate-limiting step in cytosolic aldehyde dehydrogenase through random mutagenesis[J].Biochemistry，2006，45（31）：9445-9453.

[53]Machielsen R，Looger L L，Raedts J，et al. Cofactor engineering ofLactobacillus brevisalcohol dehydrogenase by computational design[J].Eng. Life Sci.，2009，9（1）：38-44.

[54]Wang Q，Wu H，Wang A，et al. Prospecting metagenomic enzyme subfamily genes for dna family shuffling by a novel pcr-based approach[J].J. Biol. Chem.，2010，285（53）：41509-41516.

[55]諶容，王秋巖，楊兵，等. 溫泉環(huán)境宏基因組文庫(kù)中醛脫氫酶基因的克隆及鑒定[J]. 杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010,8（4）：286-289.

[56]王普，祖蕾，何軍邀，等. 基因工程菌在不對(duì)稱還原制備手性醇中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 化工進(jìn)展，2008，27（7）：977-1002.

[57]劉慶彬. 酶催化工藝用于制藥工業(yè)的研究進(jìn)展[J]. 化工進(jìn)展，2004，23（6）：590-594.

Progress of asymmetric reduction with alcohol dehydrogenase for preparation of chiral alcohols

CHEN Rong1，2，WANG Qiuyan1，YIN Xiaopu1，WEI Dongzhi2，XIE Tian1
（1Center for Biomedicine and Health，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310012，Zhejiang，China；2State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，New World Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

For preparative applications in asymmetric reduction with alcohol dehydrogenase，three issues have to be considered：An appropriate enzyme，an efficient coenzyme-regenerating method and a suitable in vitro evolution technique. Enzyme is the source of effective biocatalyst. The native or recombinational alcohol dehydrogenases fromRhodococcussp.，Lactobacillussp.，Leifsoniasp. and thermophilic microbiology，and their catalysis were analyzed. The advantages and disadvantages of coenzyme-regeneration methods were discussed. The efficient coenzyme-regeneration can decrease costs for large-scale application. In vitro evolution technique can improve the activity，stability and selectivity of target enzyme. The final aim is to establish effective and green ways to obtain chiral drug intermediates by enzymatic synthesis.

alcohol dehydrogenase；chiral Intermediates；coenzyme regeneration；in vitro evolution

Q 599

A

1000–6613（2011）07–1562–08

2011-01-10；修改稿日期：2011-02-24。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21006018）及浙江省科技廳（2009C31086）及杭州師范大學(xué)中青年培育基金（2010QN19）項(xiàng)目。

諶容（1984—），女，博士研究生。E-mail rchen1984@ 163.com。聯(lián)系人：謝恬，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail tianxie.hznu@ gmail.com。