呂俊海，李 敏，劉 紅，仝小林，于友華，孫明杰△

(1.中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心，北京 100700;2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

本研究以痰(濕)熱互結和熱盛傷津型2型糖尿病患者為研究對象，采用基因芯片技術，考察兩種證型2型糖尿病患者與正常對照組以及兩種證型之間的外周血單個核細胞的基因表達譜特征，為從中發(fā)現(xiàn)和闡明在相應證型Ⅱ型糖尿病的發(fā)病及進展中起關鍵作用的基因及信號通路打下基礎，并為中醫(yī)診斷和治療該疾病提供精確的現(xiàn)代科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

20名受試者被納入本研究。10名為2型糖尿病痰熱互結型 (A組)，平均年齡為41.7歲;4名為 Ⅱ型糖尿病熱盛傷津型(B組)，平均年齡為44.5歲;6名為年齡和性別匹配的正常對照(C組)，平均年齡為38.3歲。2型糖尿病西醫(yī)診斷符合1999年WHO診斷標準。各證型的中醫(yī)診斷標準依據(jù)國家《糖尿病中醫(yī)防治指南》及 SFDA《中藥新藥臨床研究指導原則》證型診斷標準。

1.2 樣品制備

抽取每名受試者8ml全血置于含0.1ml 1%肝素抗凝管中，采用 Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，用 TRIzol(Invitrogen)試劑抽提 PBMC RNA并用 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)純化，采用分光光度計 (Nanodrop ND-1000)和1%瓊脂糖凝膠電泳評價 RNA的質(zhì)量和完整性。隨后采用基于 T7擴增方法取1μg RNA進行線性擴增，其余存放于－80℃冰箱中以備后續(xù)實驗。反轉(zhuǎn)錄過程中進一步用 Cy3(Ambion Amino Allyl MessageAMPⅡaRNA labeling kit)標記 aRNA。

1.3 芯片雜交

標記后的 aRNA純化后與芯片(Human OneArrayTMmicroarray)雜交，42℃雜交箱中避光雜交18h后用 1×SSC/0.2%SDS洗滌 10min，0.1×SSC/0.2%SDS洗滌 10min，重復2次，0.1×SSC洗片5min，重復2次。每樣品做2個雜交重復。

1.4 掃描和分析

最后在Axon GenePix 4000B掃描儀獲取圖像，使用GenePix pro V6.0軟讀取圖像初始信號值。信號值和信噪比(SNR)均大于0的基因進入下一步分析。用 Expander軟件進行標準化(Quantile Normalization)處理后，采用倍數(shù)變化(≥1.5)，和 t檢驗方法(P≤0.05)篩選兩組樣本間的差異表達基因。

2 結果

2.1 RNA提取質(zhì)量

所提取的20例全血樣品PBMC的RNA的A260/A280均位于1.97和2.02之間，A260/A230均大于 1.95，說明 RNA的純度很高。RNA電泳28S與18S條帶清晰，亮度較高(見圖 1)，證實所有標本的RNA滿足芯片實驗要求。

2.2 基因芯片結果

2.2.1 圖2為3組樣本PBMC基因表達譜的散點圖，圖中的點絕大部分集中在比值為 1的斜線周圍，各組間信號強度R值接近于1，說明各組芯片雜交的信號強度一致性很好。

2.2.2 差異表達基因

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2 雜交信號強度組間比較散點圖X軸和Y軸均為信號強度的log2值

根據(jù)篩選標準(表達差異倍數(shù)大于1.5，P值小于0.05)，將這3組樣本表達譜分別進行比較。A組與C組相比，共有72條差異基因，其中7條為上調(diào)，65條為下調(diào);B組與 C組相比，共有23條差異基因，其中13條為上調(diào)，10條為下調(diào);A組與 B組相比，共有85條差異基因，其中22條為上調(diào)，63條為下調(diào)。表1～3列出部分各組間差異基因、編碼蛋白或功能以及其在染色體上定位。從所得數(shù)據(jù)中還可看出基因ART1在B組中表達較A組和C組都高;基因KIAA1984和TRA2A在A組和B組中表達均低于 C 組;基因 CTSL、CYLD、IGSF4C、MDS009、PTPN2、RBM13和STK16在A組中表達較B組和C組均為低;基因C9orf127在 A組表達高于 C組，而在B組表達低于C組。

表1 A組與C組比較部分表達差異基因

表2 B組與C組比較部分表達差異基因

表3 A組與B組比較部分表達差異基因

3 討論

2型糖尿病在中醫(yī)學該病屬于消渴病范疇，其早中期中醫(yī)證候以痰(濕)熱互結、熱盛傷津、氣陰兩虛為主［4、5］。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，多個基因變異與環(huán)境因素的影響共同決定該病的易感性。我們以西醫(yī)糖尿病為基礎，利用芯片技術，考察痰(濕)熱互結、熱盛傷津型病人在表達譜上的特征，為其證候生物學基礎進行有益的探索，同時對確認中藥的作用靶點及闡明糖尿病發(fā)病機理提供理論依據(jù)。

研究結果顯示，2種不同證型的2型糖尿病組分別與正常對照組相比較，所得差異表達基因種類和數(shù)目大為不同，同時兩類患者的基因表達也有明顯差異，說明痰(濕)熱互結和熱盛傷津型2型糖尿病在基因表達水平上有著質(zhì)的區(qū)別，提示中醫(yī)證候的區(qū)分應有其分子水平物質(zhì)基礎。同時通過對差異表達基因編碼產(chǎn)物的生物學功能及相關信號通路的進一步研究，可為闡明中藥的作用位點和指導對相應中藥的篩選及評價提供現(xiàn)代分子生物學依據(jù)。

基因TRA2A和BLVRA在A組和B組中表達均低于C組。TRA2A的編碼蛋白調(diào)控著轉(zhuǎn)錄后RNA的編輯，使之釋出不同蛋白變體，它的表達量下降有可能使得某些基因產(chǎn)物的缺乏，從而促進了糖尿病的發(fā)生和病理發(fā)展過程。BLVRA、膽綠素還原酶A是將膽紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素的重要酶。膽綠素被證實是很重要的生理性氧自由基清除劑，被認為是最佳的抗自由基物質(zhì)［3］。慢性高血糖狀態(tài)以及游離脂肪酸(FFA)增高均可造成氧化應激的增強，使單核細胞產(chǎn)生的 ROS增多，促炎癥轉(zhuǎn)錄因子NFκB活性增強，從而產(chǎn)生一系列促炎癥反應，這對于糖尿病的繼發(fā)損傷和并發(fā)癥的產(chǎn)生與發(fā)展起重要作用。

基因CTSL、組織蛋白酶L參與許多特殊的生理過程，如激素原的激活、抗原呈遞等。但在病理狀態(tài)下，各種原因所致的細胞損傷導致溶酶體膜穩(wěn)定性降低，通透性增高甚至破裂，大量CL釋放到胞質(zhì)或組織間隙并被激活，可降解細胞成分或細胞間質(zhì)基質(zhì)成分，包括層黏素、IV型膠原纖維及纖維連接素等，與人類許多疾病有關［4］。基因 CYLD編碼一種蛋白酶，具有內(nèi)源性泛素酶活性，其在調(diào)節(jié) NF-kappa-B活化相關通路中起重要作用，如影響細胞生長、微管蛋白穩(wěn)定性、自身免疫等等;這種蛋白發(fā)揮正常功能需要正常的細胞因子環(huán)境支持［5］。

在A組中，與免疫有關的基因，如 IL-15和IGSF4C表達量低于另2組，提示A組患者的免疫功能低下更為明顯。加之與B組相比，A組下調(diào)基因數(shù)量遠多于B組，也就是說該組患者細胞功能下降更明顯。

綜上所述，痰(濕)熱互結、熱盛傷津型2型糖尿病患者外周血單個核細胞表達譜較正常對照人群各有其特征性改變;這2種證型患者基因表達差異也很明顯，涉及細胞代謝與信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、離子通道與運輸?shù)鞍?、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子等多條通路基因。

［1］ 趙天豫，段軍，仝小林.中醫(yī)治療糖尿病的新思路［J］.光明中醫(yī)，2002，17(5).

［2］ 牟新，周旦陽，趙進喜.糖尿病腎病中醫(yī)證候量表的研制方法探討［J］.中華中醫(yī)藥雜志(原中國醫(yī)藥學報)，2007，22(11).

［3］ 邢邯英，黃黛，野戰(zhàn)鷹，凌亦凌，趙曉云.不同HO-1表達水平對糖尿病模型大鼠血管舒張功能及NOS的影響［J］.中國老年學雜志，2009，29(23).

［4］ 賀茂林，陳安民.反義表達人組織蛋白酶 L對骨肉瘤細胞侵襲特性的影響［J］.中國矯形外科雜志，2005，13(1).

［5］ Wei Jin， Mikyoung Chang， Emmanuel M. Paul，et al.Deubiquitinating enzyme CYLD negatively regulates RANK signaling and osteoclastogenesis in mice.J Clin Invest，2008，118(5):1858.