晉志高，何原芳，景向紅

(1.煤炭總醫(yī)院，北京 100028;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700)

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，可引起血管功能和結(jié)構(gòu)的損傷，導(dǎo)致血流的改變而加重腦缺血，由此導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。本研究擬采用CREB為切入點(diǎn)，觀察針刺對(duì)糖尿病大鼠海馬和杏仁復(fù)合體內(nèi)CREB表達(dá)的影響，為糖尿病腦病的研究和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Wister大鼠(雄性1個(gè)月齡)36只，體重180g±15g。

1.2 建立動(dòng)物模型

1.2.1 學(xué)習(xí)和記憶能力訓(xùn)練 隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物自由游泳2min。正式實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練4次，即由起點(diǎn)處將動(dòng)物放入書(shū)中，游至終點(diǎn)經(jīng)平臺(tái)出水為止。每次180s，隨機(jī)從東、西、南、北4個(gè)入水點(diǎn)選擇1個(gè)，將動(dòng)物面向池壁放入水中，記錄動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期(escape latency)。

空間搜索實(shí)驗(yàn):用于測(cè)量動(dòng)物對(duì)平臺(tái)空間位置準(zhǔn)確記憶，即記憶保持能力。測(cè)量180s內(nèi):(1)動(dòng)物在目標(biāo)象限(原平臺(tái)所在象限)(target quadrant)和其他各象限的游泳時(shí)間;(2)動(dòng)物在目標(biāo)象限和其他各象限游泳路徑的長(zhǎng)短。每次記錄潛伏期，即由入水到開(kāi)始游泳的時(shí)間;運(yùn)動(dòng)時(shí)間，即由起點(diǎn)游到終點(diǎn)的時(shí)間;錯(cuò)誤的次數(shù)，既改變游泳的方向或進(jìn)入盲端的次數(shù)。每只動(dòng)物共計(jì)訓(xùn)練28次，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)7 d。計(jì)算每天各組動(dòng)物4次逃避潛伏期的平均值。平均運(yùn)行時(shí)間;正確率 (正確數(shù)/訓(xùn)練次數(shù))。最后以平均潛伏期小于5 s，平均運(yùn)行時(shí)間小于15 s，正確率大于90%作為標(biāo)準(zhǔn)，判定是否建立了空間辨別性學(xué)習(xí)記憶模型。

1.2.2 DM學(xué)習(xí)記憶障礙模型的建立 試劑:鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，臨用前以無(wú)菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制 pH=4.2，濃度為25mg/ml的工作液。美國(guó) Ames公司 Glucometer3微量血糖測(cè)定儀和血糖試紙檢測(cè)。確定學(xué)習(xí)和記憶能力訓(xùn)練成功后，36只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC，9只)和模型組(27只)，模型組大鼠禁食10h，按50mg/kg劑量向大鼠腹腔內(nèi)注入25mg/ml濃度的 STZ，注藥后48h測(cè)血糖，血糖連續(xù)2次超過(guò)168mmol/L并穩(wěn)定5d者選為糖尿病模型。

表1、2顯示，造模后第18天做行為學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示DM模型組在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比短，游距離的百分比也短，與正常組的游泳時(shí)間百分比及游泳距離百分比比較有顯著差異，說(shuō)明糖尿病組動(dòng)物存在明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

24只動(dòng)物經(jīng)行為學(xué)測(cè)定被確認(rèn)為學(xué)習(xí)記憶障礙，再將動(dòng)物隨機(jī)分為模型組(DM)、針刺組(AP)、BDNF治療組(BD)3組，每組8只。

表1 治療前正常組與模型組游泳時(shí)間比較

表2 治療前正常組與模型組游泳距離比較

1.3 針灸及BDNF治療

1.3.1 針刺治療 被確認(rèn)為學(xué)習(xí)記憶障礙后當(dāng)天開(kāi)始治療，針刺治療從調(diào)督脈入手，因督脈為陽(yáng)脈之海，總督一身之陽(yáng)。刺激督脈，可振奮一身之陽(yáng)，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育;督脈絡(luò)腎入腦，刺督脈可補(bǔ)髓益腦，改善智力。選取督脈的“百會(huì)”、“大椎”，電針治療(2Hz，3mA)，留針 20min，隔日 1 次，共治療 10次。

1.3.2 BDNF治療 動(dòng)物椎管內(nèi)腔注射BDNF(10ug/kg體重，生理鹽水溶液)，第1周2次，共2次。

正常組和模型組動(dòng)物與前2組動(dòng)物在相同條件下飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何治療。

1.4 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物治療3周后，再做行為學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)后，3組動(dòng)物均經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40mg/Kg體重)腹腔麻醉后，行常規(guī)心臟灌流固定。

1.4.1 取材 剪開(kāi)前胸壁，縱形剪開(kāi)心包，充分暴露心臟。0.2 ul肝素鈉抗凝，在心端左處的左心室插管至升主動(dòng)脈，止血鉗將心臟與針頭固定，剪開(kāi)右心耳，快速滴入室溫下的生理鹽水約定100ml沖洗。續(xù)用4℃的4%多聚甲醛(0.1BMP配制，pH=7.4)150ml～200ml灌注固定，先快后慢，40min灌完后立即開(kāi)顱取腦。4℃冰箱過(guò)夜至組織塊沉底。

1.4.2 切片 對(duì)端腦做額狀面冰凍切片，組織于恒冷箱機(jī)切片機(jī)內(nèi)行連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，每隔2片取2片，裱片于預(yù)涂硌釩明膠的載玻片上，晾干后分為2套，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.4.3 免疫組化染色法(一抗為 BDNF，CREB)(1)切片經(jīng)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min;(2)滴加試劑 A(藍(lán)色液體)，室溫孵育 10min～15min，傾去勿洗;(3)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，室溫孵育24h;(4)PBS沖洗3min/次，3次;(5)滴加試劑B(黃色液體)室溫或37℃孵育10min～15min，過(guò)夜12h;(6)PBS沖洗，3min/次，3次;(7)DAB顯色，避光、顯色10min～30min，肉眼觀察;(8)自來(lái)水充分水洗;(9)脫水、透明、樹(shù)膠封片。

普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組動(dòng)物海馬、杏仁核及扣帶回等區(qū)的陽(yáng)性表達(dá)情況。陽(yáng)性標(biāo)記物為棕褐色，用MIS2000圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記細(xì)胞書(shū)的測(cè)定及積分光密度測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，組間差異采用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 治療后各組行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，在隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)中，各組動(dòng)物的逃避潛伏期均隨游泳次數(shù)增多而減少，波形呈鋸齒狀，說(shuō)明動(dòng)物對(duì)前次的學(xué)習(xí)有遺忘。第8天撤除目標(biāo)象限臺(tái)子，進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，計(jì)算大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和所游距離的百分比，用來(lái)檢測(cè)記憶力保持能力。結(jié)果顯示，DM模型組游泳距離的百分比也最短(19.55±3.47%)，在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比最短(26.77±3.56%)，說(shuō)明糖尿病組動(dòng)物存在明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，針刺治療后動(dòng)物在目標(biāo)象限停留時(shí)間(34.44±5.48%)和所游的距離(24.69±4.37%)明顯優(yōu)于 DM 模型組(表 3、4)，其P值均小于0.05。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

表3 各組動(dòng)物治療后游泳距離(百分比)比較

表4 治療后游泳時(shí)間百分比

CREB免疫組化陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞分布于廣泛的腦部區(qū)域，標(biāo)記細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿棕黃色的陽(yáng)性反應(yīng)顆粒，胞核不著色，海馬區(qū)域的標(biāo)記神經(jīng)元最多(圖1)，著色最深，體積為中等大小最多，形狀均為圓形，樹(shù)突無(wú)染色。表5顯示，4組海馬陽(yáng)性標(biāo)記物細(xì)胞比較，正常組 NC最高，ACP組次之，BD組再次之，DM組最低，前3組與DM組比較有顯著性差異(P<0.05)。標(biāo)記物光密度比較，正常組 NC最高，ACP組次之，BD組再次之，DM組最低，前3組與DM組比較有顯著性差異(P<0.05)。表6顯示，杏仁核的CREB陽(yáng)性標(biāo)記物與海馬區(qū)域數(shù)量較少，標(biāo)記也較淺，標(biāo)記物光密度比較，正常組 NC最高，ACP組次之，BD組再次之，DM組最低，前3組與DM組比較有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 海馬出現(xiàn)CREB陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元。NC:正常組，AP:針灸治療組，BD:BDNF治療組，DM:糖尿病模型對(duì)照組

3 討論

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，老年性癡呆與2型糖尿病的發(fā)病率均呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢(shì)，二者具有明顯相關(guān)性[1、2]。DM引起的腦功能障礙是一個(gè)多因素的病理過(guò)程，可引起血管功能和結(jié)構(gòu)的損傷，導(dǎo)致血流的改變而加重腦缺血，增加中風(fēng)的死亡率，對(duì)由此導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙也沒(méi)有很好的治療方法。以往的研究表明，針刺療法對(duì)糖尿病神經(jīng)病變和腦缺血都具有良好的療效[3]，與針刺能改善微循環(huán)、緩解組織缺氧有關(guān)，調(diào)節(jié)海馬內(nèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，也與針刺能夠直接或間接地影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)[4，5];針灸結(jié)合減量西藥可以較理想地控制2型糖尿病患者的血糖、血脂，既減少了藥物帶來(lái)的副反應(yīng)，又可以預(yù)防血管病變引發(fā)的并發(fā)癥的發(fā)生，因而得到廣泛的臨床應(yīng)用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

表5 治療后各組海馬CREB陽(yáng)性標(biāo)記物光密度值比較

表6 治療后各組杏仁核CREB陽(yáng)性標(biāo)記物管密度值比較

CREB(環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)是轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。CREB磷酸化后調(diào)控神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)及其誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，增加轉(zhuǎn)錄速度，改變基因表達(dá)在各種應(yīng)激性腦損傷，通過(guò)表達(dá)有效存活因子，在組織細(xì)胞修復(fù)、再生中起重要作用。CREB也具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能[6]，是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的一種關(guān)鍵成分。目前大量研究已表明，細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成長(zhǎng)期記憶的變化需要依賴CREB的轉(zhuǎn)錄，CREB是長(zhǎng)期記憶形成過(guò)程所必需的一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子。學(xué)習(xí)記憶行為訓(xùn)練前向大鼠海馬內(nèi)注入CREB的反義寡核苷酸可導(dǎo)致其在Morris水迷宮中的空間學(xué)習(xí)缺陷，而訓(xùn)練前雙側(cè)穹隆海馬傘被切斷的大鼠，也可因海馬CREB的水平不能升高而致逃避性記憶受損。Nagakura等[7]發(fā)現(xiàn)，癡呆大鼠在水迷宮訓(xùn)練后逃避潛伏期延長(zhǎng)，海馬等腦區(qū)的 CREB的含量有所下降。Herdegen等[8]用免疫組化方法觀察了大鼠大腦皮層中包括CREB在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CREB與早期基因(immediate-early genes，IEGs)的編碼的核蛋白不同:IEGs受刺激誘導(dǎo)可以快速表達(dá)合成出新的蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用，而CREB受刺激后并無(wú)新的合成，只需要通過(guò)活化原有的CREB發(fā)揮作用。細(xì)胞內(nèi)CREB有2種存在形式:單體和二聚體，CREB二聚體的 DNA親和力與轉(zhuǎn)錄活性均明顯高于單體，其間可以相互轉(zhuǎn)化。CREB二聚體又依其磷酸化程度分為無(wú)磷酸化、半磷酸化和磷酸化的二聚體。第1種與內(nèi)源CRE親和力較低，無(wú)轉(zhuǎn)錄活性;第2種有一定DNA結(jié)合活性，但轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性很低;只有第3種的親和力和轉(zhuǎn)錄活性作用均較高，所以一般認(rèn)為，前2種為CREB的無(wú)活性形式，而第3種為 CREB的活性形式[8]。由此不難推測(cè)，磷酸化與脫磷酸化是調(diào)節(jié)CREB活性的重要機(jī)制之一。目前，研究最多CREB磷酸化的蛋白激酶是 PKA，它可使 CREB的 Ser-133位磷酸化。PKA-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、再生和分化。實(shí)驗(yàn)證明，PKA-CREB信號(hào)傳導(dǎo)通路與突觸的可朔性及學(xué)習(xí)記憶功能有密切的關(guān)系[9]。我們也觀察到，DM學(xué)習(xí)記憶障礙模型大鼠海馬及杏仁核內(nèi)CREB表達(dá)降低，針刺可使其升高。我們的結(jié)果顯示，CREB免疫組化陽(yáng)性標(biāo)記神經(jīng)元的體積比BDNF陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞小，海馬區(qū)域的標(biāo)記神經(jīng)元最多，著色最深，體積也為中等大小最多，形狀均為圓形，樹(shù)突無(wú)染色，在陽(yáng)性標(biāo)記物細(xì)胞數(shù)量上ACP組與DM組比較有顯著性差異，標(biāo)記物光密度比較有顯著性差異，證實(shí)海馬和杏仁核參與了針刺調(diào)節(jié)CREB的表達(dá)。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶A-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(protein kinase A-cAMP reponse elment binding protein，PKA-CREB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、再生和分化。實(shí)驗(yàn)證明，PKA-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與突觸的可朔性及學(xué)習(xí)記憶功能有密切的關(guān)系[10]。隨著腦缺血分子機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)急性腦缺血可以激活內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制PKA-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。CREB被認(rèn)為是在開(kāi)啟從短時(shí)記憶到長(zhǎng)時(shí)記憶的關(guān)鍵，所以可能與改善記憶力的缺乏及認(rèn)知有關(guān)系。在年長(zhǎng)的動(dòng)物大腦海馬內(nèi)CREB經(jīng)磷酸化后，即磷酸化CREB的活動(dòng)水平明顯低于年輕組的動(dòng)物，而在大腦受損的年長(zhǎng)動(dòng)物的CREB活動(dòng)可能提示與空間工作記憶缺乏有關(guān)。而缺血缺氧性損傷可引起海馬亞區(qū)不同形式的細(xì)胞死亡。其表現(xiàn)為CA1細(xì)胞凋亡，CREB磷酸化丟失。CA3區(qū) 及齒狀回顆粒細(xì)胞不發(fā)生改變，伴隨CREB磷酸化增強(qiáng)并且先于細(xì)胞死亡的發(fā)。這些證據(jù)表明CREB的活化對(duì)海馬神經(jīng)元的存活起重要作用。

針灸治療消渴病最早見(jiàn)于淳于意的診籍《史記·扁鵲倉(cāng)公列傳》:“齊章武里曹山跗病，臣意診其脈曰:‘肺消癉也，死不治。所以知山跗病之府者，臣意切其脈，肺氣熱也。臣意未往診時(shí)，齊太醫(yī)先診山跗病，炙其足少陰脈口;又灸其少陰脈，而飲之半夏丸。”這是最早循經(jīng)脈用以灸法治療消渴病的病案記錄。晉·皇甫謐的《針灸甲乙經(jīng)》記錄了大量具有治療消渴病主要癥狀的腧穴，如腕骨、意舍、然谷、承漿，太溪主治“消渴”、“消癉”;魚(yú)際、少商、曲池、隱白、勞宮、中封、太沖、行間等治療消渴病以渴或嗜飲為主的癥狀，而治療消渴病熱中消谷善饑主要選取足三里，指出足三里主“消中”?！都滓医?jīng)》卷七第一下:“邪在脾胃，則病肌肉痛。陽(yáng)氣有余，陰氣不足，則熱中善饑，三里主之?！?0世紀(jì)50年代開(kāi)始針刺治療糖尿病出現(xiàn)了個(gè)案報(bào)道，隨后在60年代出現(xiàn)大樣本的病歷觀察和分析，在80年代多以針刺治療糖尿病并發(fā)癥和針刺作用機(jī)理為研究的重點(diǎn)。針刺治療可以促進(jìn)腦內(nèi)源性BDNF蛋白的合成，可能也是針刺有效治療缺血性腦損傷的機(jī)制之一。王俊英等[11]觀察用電針鎮(zhèn)痛的累積效應(yīng)與大鼠下丘腦、海馬蛋白激酶A表達(dá)的變化，推測(cè)電針鎮(zhèn)痛的積效應(yīng)可能與下丘腦、海馬細(xì)胞PKA的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，并且與動(dòng)物神經(jīng)記憶有密切關(guān)系。電針能有效地逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠海馬PKA、PKC的陽(yáng)性表達(dá)。認(rèn)為電針對(duì)治療抑郁可能是通過(guò)調(diào)節(jié)海馬細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)酶的功能而實(shí)現(xiàn)的。

本文的研究結(jié)果證實(shí)，DM學(xué)習(xí)記憶障礙模型大鼠海馬及杏仁核內(nèi)CREB表達(dá)降低，針刺可使其升高。針刺可能通過(guò)調(diào)節(jié)PKA-CREB信號(hào)通路促進(jìn)BDNF的合成及分泌，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生功能，從而可影響學(xué)習(xí)與記憶。這可能是針刺治療老年癡呆的神經(jīng)機(jī)制。

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