郭艾英，凌 云，張志雯

(1河北科技師范學院生命科技學院，河北秦皇島，066600;2中糧華夏長城葡萄酒有限公司)

蛋白酶是一類可催化蛋白質水解反應的酶，是重要的工業(yè)用酶之一，已被廣泛應用于食品、洗滌、皮革、飼料等工業(yè)。目前國內蛋白酶在常溫和低溫下酶活力不高，不能滿足市場需求，大規(guī)模用酶主要依賴進口［1］。海洋微生物自身生長環(huán)境(高壓、高鹽、低溫、低營養(yǎng)、低光照等)決定其分泌的胞外酶具有在低溫和高鹽存在下能夠繼續(xù)保持較高的活力，并且經過溫和的熱處理即可使低溫酶活力喪失或低溫菌株選擇性失活，而不會影響產品的品質，這使得該酶也能夠應用于某些條件苛刻的生產工藝中［2～4］。對海洋微生物低溫酶的研究與開發(fā)，已在國內外引起了廣泛關注。由海洋微生物生產低溫酶已成為發(fā)達國家開發(fā)新型酶制劑的重要途徑［5～7］，國內已經從黃海海水、北極沉積物或海水中分離到多株產低溫蛋白酶的菌株［1，8～10］，其菌種、酶的性質也不盡相同。作者首次從渤海海域采集的樣品分離獲得一株產蛋白酶活力較高的菌株HYM－16，初步鑒定為黃色桿菌屬，該菌株所產的蛋白酶在4℃條件下處理48 h，酶活保持不變，屬低溫酶，筆者對其生長條件進行分析，以期為工業(yè)應用和后續(xù)研究奠定理論和應用基礎。

1 材料和方法

1．1 樣品采集

2009年10月上旬于渤海秦皇島海域東經119°60′，北緯39°93′附近，采集海水樣品共20份。

1．2 培養(yǎng)基

1．2．1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，作為菌體初篩和斜面菌種保藏用。

1．2．2 篩選培養(yǎng)基 葡萄糖 0．5 g/L，KH2PO40．5 g/L，K2HPO40．5 g/L，酪蛋白 10 g/L，瓊脂 20 g/L，用于篩選蛋白酶產生菌。

1．2．3 種子培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L。

1．2．4 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖0．5 g/L，K2HPO40．5 g/L，KH2PO40．5 g/L，蛋白胨 10 g/L。以上培養(yǎng)基pH 7．2～7．4，均用陳海水代替蒸餾水配制，121℃滅菌30 min。

1．3 菌株篩選

1．3．1 菌株初篩 將采集到的樣品經肉湯培養(yǎng)基富集培養(yǎng)24 h，用滅菌陳海水進行梯度稀釋后涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待形成單菌落，再點種于篩選平板進行初篩。培養(yǎng)48 h后，在菌落周圍滴加10 g/L三氯乙酸，以鋪滿平板為度。選取水解圈較大的菌株，平板劃線純化，斜面保藏，備用。

1．3．2 菌株復篩 將初篩菌株接種于裝液量50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，180 r/min，25℃震蕩培養(yǎng)48 h，收集發(fā)酵液進行酶活力測定。

1．4 酶活力測定

將發(fā)酵液在4 500 r/min，4℃離心10 min，取上清液作為粗酶液，采用Folin－酚法測定蛋白酶活力［11］。以1 mL酶液在一定條件下每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1．5 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1．5．1 培養(yǎng)時間對菌株產酶的影響 挑1環(huán)菌株接入種子培養(yǎng)基，180 r/min，震蕩培養(yǎng)12 h，以體積分數(shù)為 0．01 的菌液轉接發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min，25 ℃震蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng) 12，24，36，48，60，72 h，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．2 接種量對產酶的影響 將震蕩培養(yǎng)12 h的種子液，分別以體積分數(shù)為0．005，0．010，0．015和0．020的菌液轉接發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min，25℃的條件下震蕩培養(yǎng)，48 h后測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．3 搖床轉速對產酶的影響 將震蕩培養(yǎng)12 h的種子液，以體積分數(shù)為0．01的菌液轉接發(fā)酵培養(yǎng)基，控制搖床轉速分別為120，140，160，180，200，220 r/min，25 ℃的條件下震蕩培養(yǎng)，48 h 后測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．4 不同碳源、氮源對產酶的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入相同質量濃度(0．5 g/L)的4種碳源(麥芽糖、蔗糖、乙酸鉀、淀粉)和4種氮源(硝酸鉀、酵母粉、豆餅粉、硫酸銨)，研究其對產酶的影響。將震蕩培養(yǎng)12 h的種子液，以體積分數(shù)為0．01的接種量，培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．5 不同金屬離子對產酶的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質量濃度為0．1 g/L的4種不同金屬離子(Mg2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Ca2+)，將震蕩培養(yǎng)12 h的種子液，以體積分數(shù)0．01接種量，培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．6 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗 選擇影響酶活的碳源、氮源和金屬離子為考慮因素，選用L9(34)正交設計(表1)，以酶活力為指標，優(yōu)化培養(yǎng)基的組成成分。

2 結果與分析

2．1 菌株的分離

將取得的水樣20份，經富集培養(yǎng)，稀釋涂布，培養(yǎng)18～24 h后得到148個單菌落，挑取單菌落于篩選平板上培養(yǎng)，37株分泌蛋白酶。挑選其中D/d大于3的13株經搖瓶復篩，依據(jù)Folin－酚法測定蛋白酶活，確定HYM－16號菌株，酶活達410．1×103U·L－1，是一株性能良好的出發(fā)菌株。國內報道的出發(fā)菌株的活力在100×103U·L－1上下［10］。該菌株在篩選平板上培養(yǎng)48 h時所形成的水解圈如圖1所示。

表1 正交試驗因素水平表 g·L－1

圖1 HYM－16菌株在篩選平板培養(yǎng)48 h產生的水解圈

2．2 菌種的初步鑒定

篩選的HYM－16菌株為長桿狀，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈圓形同心環(huán)，臍狀，邊緣整齊，表面閃光，油脂狀，淺黃色。生理生化反應為革蘭氏染色陰性，接觸酶陽性，好氧，能在甲醇、乙醇、丙醇丁醇和有機酸為唯一碳源時異養(yǎng)生活。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］相關內容，初步鑒定為黃色桿菌屬(Xanthobacter sp．)。

2．3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2．3．1 培養(yǎng)時間對產酶的影響 在不同培養(yǎng)時間處理下，測定酶活力，該菌株在12 h開始產酶，24 h后大量產酶，至48 h時，酶產量達到高峰，酶活為416．6×103U·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)，酶活力顯著下降(圖2)。其原因可能是在發(fā)酵前期菌體經過短暫的適應期即進入對數(shù)生長期，外部環(huán)境有利于菌體的生長和代謝產物的合成，在48 h產酶量達到最大;到發(fā)酵后期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質減少，產物量及有害代謝物的增多抑制菌體的生長和產物的合成，造成酶活力的下降，因此選擇48 h為最佳培養(yǎng)時間。

2．3．2 不同接種量對產酶的影響 在三角瓶裝液量相同的條件下，測試了不同接種量對產酶的影響(圖3)。結果表明，接種量的大小對產酶影響較大，接種量較低和較高都會抑制酶活，體積分數(shù)0．01時蛋白酶活力最大。小于0．01時，隨接種量的增加其產酶活力也增大，再增加接種量，酶活反而降低。這可能是接種量較小時，菌體產生的胞外酶較少，影響菌體對營養(yǎng)物質的利用，抑制產酶，而接種量較大時，菌體生長過快，發(fā)酵液黏度增加，造成溶氧不足，影響產物的合成。

圖2 不同培養(yǎng)時間對產酶的影響

圖3 不同接種量對產酶的影響

2．3．3 不同搖床轉速對產酶的影響 在其它條件相同的情況下控制不同的搖床轉速，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力(圖4)。結果表明，隨著搖床轉速的增加，產酶量增多，180 r/min時產酶量最大，為411．3×103U·L－1，再增大轉速，產酶量有所下降。說明搖床轉速影響培養(yǎng)液的溶氧量，適當?shù)娜苎跛接欣谠摼甑纳L和代謝產物的合成，但溶氧太高反而抑制蛋白酶的形成。

2．3．4 不同碳源、氮源對產酶的影響 在產酶基礎培養(yǎng)基中試驗了相同濃度的4種碳源和氮源，培養(yǎng)后測定蛋白酶活力(圖5)。結果表明，碳源中蔗糖效果最好，產酶量最高，酶活為506．4×103U·L－1，其次為葡萄糖和淀粉。蔗糖優(yōu)于葡萄糖的原因可能是菌體以蔗糖作為碳源可解除葡萄糖效應，與國外報道的葡萄糖抑制蛋白酶的生成相似［13］;淀粉作為一種廉價的碳源也具有較高的產酶水平，可能是其中含有復雜蛋白成分具有誘導作用。

菌株利用有機氮源產酶能力均高于無機氮源，其中豆餅粉效果最好，達468．0×103U·L－1(圖6)，酵母浸出物和蛋白胨次之。其原因可能是無機氮源成分較單一，影響產酶量;(NH4)2SO4為生理酸性物質，影響產酶環(huán)境的pH，抑制蛋白酶的分泌，因而產量最低，此研究結果與Sinha報道的硫酸銨對產酶的促進作用存在分歧［14］;而有機氮源中可能含有的無機鹽、較豐富的B族維生素及生長因子促進了蛋白酶的產生，與Sen和Gajju等的研究結果一致［13，15］。因此確定豆餅粉為后續(xù)試驗氮源。

圖4 搖床不同轉速對產酶的影響

圖5 不同碳源對產酶的影響

2．3．5 金屬離子對產酶的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以適宜濃度添加4種金屬離子考察對蛋白酶活的影響(圖7)，結果表明，較低金屬離子濃度下，與對照相比，Mg2+和Ca2+對該菌產酶具有促進作用，F(xiàn)e2+和Mn2+則對蛋白酶抑制作用明顯，其中Fe2+作用更強，酶活僅是對照的10．99%。這可能是由于Ca2+和Mg2+穩(wěn)定酶結構的同時，也起到了激活酶的作用;而Mn2+及Fe2+可能與酶中心的活性基團結合形成化合物，導致蛋白酶活力下降。

圖6 不同氮源對產酶的影響

圖7 不同金屬離子對產酶量的影響

2．3．6 碳源、氮源和金屬離子合適濃度對產酶的影響 產酶最適培養(yǎng)基優(yōu)化試驗結果如表2表3所示，由表2各列的極差R值和表3中F值可得，各因素影響主次順序為B＞A＞D＞C，即在實驗設定的因素中，氮源中豆餅粉和碳源蔗糖的添加量對菌株產酶影響顯著，而Mg2+的添加量對產酶影響不大，Sun－og等研究結果表明，高濃度的Mg2+有助于提高蛋白酶活力［16］。由2．3．5可知Mg2+的添加能夠促進產酶，但其添加量對產酶影響較小，其原因有待進一步考察。在優(yōu)化培養(yǎng)基因素水平上，對因素A和B，最大數(shù)均是K2，因此選擇A2B2，對于因素C和D選擇最大數(shù)C2D1，因此最佳組合為:A2B2C2D1，綜合基礎培養(yǎng)基得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖 1 g/L，豆餅粉 20 g/L，MgCl20．4 g/L，K2HPO40．5 g/L，KH2PO40．5 g/L。

表2 正交試驗L9(34)結果及極差分析

表3 方差分析結果

表4 培養(yǎng)基優(yōu)化后的蛋白酶活力及相對產率變化

2．4 優(yōu)化培養(yǎng)條件的驗證試驗

為了進一步驗證正交試驗優(yōu)選出的最佳組合方案A2B2C2D1，將活化菌株接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，以體積分數(shù)0．01的接種量分別轉接最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，測定酶活(表4)?？芍獌?yōu)化后的培養(yǎng)基酶活較基礎培養(yǎng)基增加了46．9%，3次試驗具有重現(xiàn)性，結果一致。

3 結 論

(1)采用梯度稀釋法從渤海海域分離得到148株單菌落，其中37株具有分泌蛋白酶的能力，經過平板初篩和搖瓶復篩確定酶活410．1×103U·L－1的HYM－16為研究的出發(fā)菌株，初步鑒定為黃色桿菌屬(Xanthobacter sp．)。

(2)研究了發(fā)酵條件、培養(yǎng)基成份對發(fā)酵產酶的影響。以酶活力為依據(jù)，得出在裝液量為50 mL的250 mL的三角瓶中，以體積分數(shù)為0．01的接種量，180 r/min進行發(fā)酵培養(yǎng)，48 h時達到最高產酶水平;最佳的碳源、氮源分別是蔗糖和豆餅粉，Mg2+能夠促進產酶。

(3)優(yōu)化培養(yǎng)條件得出各因素影響主次順序:豆餅粉＞蔗糖＞K2HP04＞MgCl2;最佳發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖 1 g/L，豆餅粉 20 g/L，MgCl20．4 g/L，K2HPO40．5 g/L，KH2PO40．5 g/L。優(yōu)化后的培養(yǎng)基較基礎培養(yǎng)基酶活提高46．9%。該蛋白酶的穩(wěn)定性較好，粗酶液在4℃條件下處理48 h后酶活不變，具有進一步開發(fā)利用的潛力。

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