李珍煉，黃玉清，張錫林，陳文碧，王光西

并殖吸蟲(chóng)?。╬aragonimiasis，又稱肺吸蟲(chóng)?。┦且活愔匾氖吃葱匀双F共患寄生蟲(chóng)病，廣泛分布于亞洲、非洲與拉丁美洲許多國(guó)家[1]。肺吸蟲(chóng)的種類較多，我國(guó)以衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)和斯氏并殖吸蟲(chóng)居多，由于并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)與童蟲(chóng)均具有游走性，在人體除引起肺部病變外，還可移行至肝臟、心包、睪丸、皮下組織，特別是幼蟲(chóng)可經(jīng)縱隔、頸部移行至顱內(nèi)，侵犯腦組織，可表現(xiàn)為癲癇、腦炎、偏癱，危害嚴(yán)重。蟲(chóng)體在組織器官內(nèi)移行、寄居的機(jī)械破壞作用，蟲(chóng)體代謝產(chǎn)物引起的免疫病理反應(yīng)，可導(dǎo)致肝、肺、腦出現(xiàn)炎癥、出血、膿腫、囊腫、纖維化等病理改變[2]。臨床表現(xiàn)極其復(fù)雜。近年來(lái)研究顯示眾多信號(hào)通路參與了全身性炎癥反應(yīng)和組織損害的病理過(guò)程。細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的 JAK-STAT[3]（janus kinase/signal transducerand activator of transcription，JAKSTAT）通路廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥、腫瘤的發(fā)生等病理生理過(guò)程，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生重要影響；核轉(zhuǎn)錄因子-Κ β（nuclear factor-kappaB ，NFΚ β）是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子[4]，廣泛存在于真核生物中。體內(nèi)外的多種刺激，如缺氧、缺血、氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)等均可激活 NF-Κ β；然而關(guān)于其在肺吸蟲(chóng)病損傷的肝、肺組織中的表達(dá)變化和意義少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以腹腔注射囊蚴感染法建立肺吸蟲(chóng)病動(dòng)物模型，旨在觀察JAK-STAT和 NF-Κ β通路在斯氏并殖吸蟲(chóng)所致肝、肺組織損傷中的表達(dá)及其作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 溪蟹采自四川省興文縣先鋒鎮(zhèn)肺吸蟲(chóng)病流行區(qū)；健康清潔級(jí)家犬，共10只，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人STAT多克隆抗體、兔抗人NF-kB（P65）多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）購(gòu)于Sigma公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB），多聚甲醛，戊巴比妥鈉，10%福爾馬林。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立肺吸蟲(chóng)病感染動(dòng)物模型 將采自肺吸蟲(chóng)病流行區(qū)的溪蟹洗凈、研碎、過(guò)濾、沉淀，在解剖顯微鏡下分離囊蚴，采用腹腔注射囊蚴法感染家犬，感染組8只，每只犬注射200個(gè)囊蚴，不感染的犬2只，為正常對(duì)照組，飼養(yǎng)觀察三個(gè)月。

1.2.2 動(dòng)物解剖和取材 感染三月后解剖犬，自肺蟲(chóng)囊取出蟲(chóng)體，經(jīng)鑒定為斯氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)。取肺、肝組織；用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化；以免疫組化染色法檢測(cè)肺和肝組織STAT和NFΚ β的表達(dá) 。

1.2.3 免疫組化法檢測(cè) STAT和NF-Κ β的表達(dá)測(cè)定步驟：組織切片，常規(guī)脫蠟水化后，蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）浸泡，高溫抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，并用正常山羊血清封閉交叉反應(yīng)。滴加一抗即兔抗人STAT多克隆抗體（1∶200）、兔抗人NF-kB（P65）多克隆抗體（1∶200）孵育，PBS 沖洗后滴加生物素標(biāo)記二抗即羊抗兔IgG室溫孵育20min，PBS沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/H RP）孵育 ，PBS沖洗 ，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片觀察。免疫組化同時(shí)加作陰性對(duì)照片（PBS代替一抗）。

STAT和NF-Κ β結(jié)果判斷：陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞染成棕黃色或有棕黃色顆粒沉積，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。由二位病理醫(yī)生按雙盲法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，即在高倍鏡下（×200）隨機(jī)觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，進(jìn)行多因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 H E染色光鏡觀察結(jié)果 觀察到感染犬肺和肝切片斯氏并殖吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵周圍有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。感染犬肺可見(jiàn)蟲(chóng)體隧道，肺泡上皮壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肝組織可見(jiàn)蟲(chóng)體隧道，肝細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)大片壞死并有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及嗜酸性膿腫形成，壞死周圍肉芽腫及纖維組織包裹，見(jiàn)夏科-雷登氏結(jié)晶；肝細(xì)胞氣球樣變，萎縮、變性、壞死，肝細(xì)胞核濃縮，界限不清；匯管區(qū)水腫，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇擴(kuò)張、瘀血；小膽管及結(jié)締組織增生，有蟲(chóng)卵沉積壞死灶。

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 犬肺組織中 JAK-STAT和NF-Κ β 免疫組化染色顯示正常對(duì)照組犬肺組織中JAK-STAT和NF-Κ β不表達(dá)或弱陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖1A和圖1C）；感染組犬肺組織可見(jiàn)JAK-STAT和NF-Κ β陽(yáng)性細(xì)胞，免疫陽(yáng)性物質(zhì)呈棕褐色，NF-Κ β在肺氣道處表達(dá)多，STAT在肺實(shí)質(zhì)處表達(dá)多 （見(jiàn)圖1B和圖1D），感染組和正常組之間存在顯著性差異（χ2=476，χ2=521，P ＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 1）。

2.2.2 犬肝組織中 JAK-STAT和NF-Κ β 免疫組化染色顯示正常對(duì)照組犬肝組織中JAK-STAT和NF-Κ β不表達(dá)或弱陽(yáng)性表達(dá)（圖 2A 和圖 2C）；感染組犬肝組織可見(jiàn)JAK-STAT和NF-Κ β陽(yáng)性細(xì)胞，免疫陽(yáng)性物質(zhì)呈棕褐色，以肝細(xì)胞壞死區(qū)最為明顯，胞質(zhì)和胞核中均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)（圖2B和圖2D）。感染組和正常組之間存在顯著性差異（χ2=405，χ2=434，P ＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

3 討 論

斯氏并殖吸蟲(chóng)病是肺吸蟲(chóng)的童蟲(chóng)在人體內(nèi)移行或寄居所引起的疾病。成蟲(chóng)寄生于犬、貓、果子貍等終宿主肺部，產(chǎn)出的蟲(chóng)卵隨痰吞咽后隨糞便排出，在水中發(fā)育孵出毛蚴，侵入擬釘螺發(fā)育，形成許多尾蚴逸出螺體，再侵入淡水蟹體內(nèi)發(fā)育成囊蚴。當(dāng)人生食或半生食含囊蚴的淡水蟹后，在小腸內(nèi)受到消化液作用，幼蟲(chóng)脫囊而出，幼蟲(chóng)鉆過(guò)腸壁，侵入腹腔竄擾，較少發(fā)育成蟲(chóng)，而是以幼蟲(chóng)狀態(tài)移行至肝、胸腔、心包、睪丸、皮下組織，或經(jīng)縱隔，進(jìn)入顱內(nèi)形成腦型肺吸蟲(chóng)病。斯氏并殖吸蟲(chóng)病的致病作用主要由童蟲(chóng)移行的機(jī)械性損傷、蟲(chóng)體代謝產(chǎn)物等抗原物質(zhì)導(dǎo)致的免疫病理反應(yīng)引起，出現(xiàn)皮膚型、內(nèi)臟型肺吸蟲(chóng)病[5]。

圖1 犬肺組織 NF-Κ β和JAK-STAT免疫組化染色表現(xiàn)圖1A.正常對(duì)照組犬肺NF-Κ β在肺實(shí)質(zhì)處低陽(yáng)性表達(dá)圖1B.斯氏并殖吸蟲(chóng)感染犬肺組織，NF-Κ β在肺氣道處陽(yáng)性表達(dá)圖1C.正常對(duì)照組犬肺JAK-STAT在氣道處低陽(yáng)性表達(dá)圖1D.斯氏并殖吸蟲(chóng)感染犬肺組織，JAK-STAT在肺實(shí)質(zhì)處陽(yáng)性表達(dá)Fig.1 Expression of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the lung tissueFig.1A NF-Κ β low expression in the lung of the normal control dogFig.1B NF-Κ β positive expression in the lung of the dog infected with Pagumogonimus skrjabiniFig.1C JAK-STAT low expression in the lung of the normal control dogFig.1D JAK-STAT positive expression in the lung of the dog infected with Pagumogonimus skrjabini

圖2 犬肝組織NF-Κ β和JAK-STAT免疫組化染色表現(xiàn)圖2A.正常對(duì)照組犬肝組織NF-Κ β低陽(yáng)性表達(dá)圖2B.斯氏并殖吸蟲(chóng)感染犬肝組織NF-Κ β陽(yáng)性表達(dá)圖2C.正常對(duì)照組犬肝組織JAK-STAT低陽(yáng)性表達(dá)圖2D.斯氏并殖吸蟲(chóng)感染犬肝組織JAK-STAT陽(yáng)性表達(dá)Fig.2 Expression of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the liver tissueFig.2A NF-Κ β low expression in the liver of the normal control dogFig.2B NF-Κ β positive expression in the liver of the dog infected with PagumogonimusskrjabiniFig.2C JAK-STAT low expression in the liver of the normal control dogFig.2D JAK-ST AT positive expression in the liver of the dog infected with Pagumogonimusskrjabini

JAK-STAT信號(hào)通路是一條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可將細(xì)胞膜感受到的信號(hào)直接傳遞至核內(nèi)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞外可溶性信號(hào)分子（細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等）識(shí)別并與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合后誘導(dǎo)受體聚化形成二聚體或三聚體。在胞質(zhì)內(nèi)形成高親和力的JAKs結(jié)合位點(diǎn)，JAKs與該結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化或與受體交叉酪氨酸磷酸化而活化?；罨腏AKs進(jìn)一步募集胞質(zhì)內(nèi)相應(yīng)信號(hào)傳遞給 STAT s，使 STATs二聚化、活化、發(fā)生核易位，結(jié)合至相應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)，啟動(dòng)基因表達(dá)，從而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。目前已知有多種細(xì)胞因子，如 TNF-a、IL-6、IL-1B、干擾素（IFN）等和生長(zhǎng)因子是通過(guò)活化 JAK-STAT通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的[6]。肺吸蟲(chóng)病時(shí)肺、肝是炎癥反應(yīng)最為活躍器官，是炎癥和免疫細(xì)胞聚集的重要部位。肝臟是機(jī)體合成免疫效應(yīng)分子的主要部位之一，合成過(guò)程與JAK-STAT信號(hào)通路密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立肺吸蟲(chóng)病模型，以免疫組化染色檢測(cè)JAK-STAT在肝組織中的定位和表達(dá)。觀察到正常對(duì)照組犬肝組織中JAK-STAT低陽(yáng)性表達(dá)；肺吸蟲(chóng)感染組，JAK-STAT信號(hào)通路被激活，活化的STAT發(fā)生核易位，直接激活目的基因表達(dá)，此時(shí)肺、肝功能和大體、組織學(xué)表現(xiàn)均出現(xiàn)異常，與JAK-STAT表達(dá)和分布的動(dòng)態(tài)變化相一致，提示肺吸蟲(chóng)病時(shí)JAK-STAT的表達(dá)和活化在肺、肝損傷過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，JAKSTAT通路參與了肺吸蟲(chóng)病肺、肝損傷的病理過(guò)程。

表1 斯氏并殖吸蟲(chóng)感染犬肺、肝 NF-Κ β和JAK-STAT免疫組化檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of detection of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the lung，liver of the dogs with paragonimiasis skrjabini

存在于真核生物中的核轉(zhuǎn)錄因子-Κ β，靜息時(shí)與其抑制蛋白IΚ β結(jié)合，以失活狀態(tài)存在細(xì)胞質(zhì)中，體內(nèi)外的多種刺激，如缺氧、缺血、氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)等均可激活NF-Κ β，當(dāng)受到激活蛋白激酶刺激時(shí)，IΚ β 磷酸化 ，泛 素化 ，降解 ，使 NF-Κ β游離 于胞 漿中，迅速發(fā)生核移位，通過(guò)它的核定位信號(hào)與DNA上相應(yīng)的Κ β位點(diǎn)特異結(jié)合，促進(jìn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[4]。肺吸蟲(chóng)感染，NF-Κ β 在損傷的肺 、肝中持續(xù)活化，通過(guò)許多潛在途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；而且NF-Κ β可誘導(dǎo)IL-1、ICAM-l、iN0S 、TNF-a 表達(dá)和鈣超載 、氧自由基的形成，加重肺、肝組織損害。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射斯氏并殖肺吸蟲(chóng)囊蚴感染犬，建立肺吸蟲(chóng)病模型，取犬肺、肝組織標(biāo)本；通過(guò)HE染色、光鏡觀察到肺吸蟲(chóng)感染犬的肺、肝組織細(xì)胞病理改變以及炎癥細(xì)胞反應(yīng)狀況；通過(guò)免疫化學(xué)染色方法檢測(cè)JAK-STAT和NF-Κ β炎癥信號(hào)通路表達(dá)，肺吸蟲(chóng)感染犬肺、肝組織的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，正常對(duì)照犬陽(yáng)性表達(dá)較低，二者存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺吸蟲(chóng)病的機(jī)械破壞和炎癥病理反應(yīng)多種刺激，造成組織缺氧、缺血、氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)等均可激活JAK-STAT和 NFΚ β表達(dá) ，說(shuō)明 JAK-STAT 和 NF-Κ β炎癥信號(hào)通路可能參與了肺吸蟲(chóng)病肺、肝組織的病理過(guò)程，為以后我們深入肺吸蟲(chóng)病的防治和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

[1]Blair D，Agatsuma T，Watanabe T，etal.Geographical genetic structure within the human lung fluke，Parag onimus westermani，detected from DNA sequences[J].Parasitology，1997，115（4）：411-417.

[2]Lee JC，Cho GS，Kwon JH，etal.Macrophageal/microglial cell activation and cerebral injury induced by ex cretory secretory products secreted by Paragonimus westermani[J].Neuroscience Research，2006，54（2）：133-139.

[3]廖新學(xué)，孫勝楠，郭瑞鮮，等.JAK-STAT 通路調(diào)制NF-Κ β 介導(dǎo)H2O2預(yù)處理的細(xì)胞保護(hù)作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2008，24（7）：1422-1427

[4]李軍，婁季宇，楊霄鵬.雌激素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織NF-κ B、iNoS表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2009，12（18）：15-16

[5]詹希美.人體寄生蟲(chóng)學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[6]Espert L，Dusanter-Fourt I，Chelbi-Alix M K.Negative regulation of the JAK/STA T：pathway implication in tumorigenesis[J].Bull Caner，2005，92（10）：845-847.