馮鳴鳳，趙 娜，王 軻，王林同，朱 琳*

1.南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過(guò)程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

2.天津市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，天津 300071

不同pH下對(duì)硝基酚(p－NP)對(duì)小球藻和斜生柵藻的毒性

馮鳴鳳1，2，趙 娜1，王 軻1，王林同1，朱 琳1*

1.南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過(guò)程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

2.天津市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，天津 300071

為研究水體中典型有機(jī)污染物的環(huán)境基準(zhǔn)，考慮環(huán)境因子對(duì)污染物生物效應(yīng)的影響，選取生長(zhǎng)速率(μ)，無(wú)可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)，最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)和半抑制濃度(EC50)為指標(biāo)，研究了不同pH(7，8和9)對(duì)小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的生長(zhǎng)以及對(duì)對(duì)硝基酚(p-NP)毒性的影響.結(jié)果表明:pH為7～9時(shí)，小球藻和斜生柵藻均可正常生長(zhǎng)，但各自最適生長(zhǎng)的pH不同，小球藻的最適生長(zhǎng)pH為8，而斜生柵藻的最適生長(zhǎng)pH為9.p-NP對(duì)小球藻和斜生柵藻的毒性均隨pH的增大而降低，pH為9時(shí)毒性最小，但p-NP對(duì)斜生柵藻的毒性比對(duì)小球藻的大，即斜生柵藻對(duì)p-NP要比小球藻更敏感.因此，在研究p-NP的水生態(tài)基準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)該考慮pH的影響.

生態(tài)基準(zhǔn);對(duì)硝基酚;pH;小球藻;斜生柵藻

Abstract:In order to study the environmental criteria of typical organic contaminants in aquatic systems，the influence of environmental factors on their biological effects was considered.End points of growth rate(μ)，NOEC，LOECandEC50were selected as evaluation indices to study the growth ofChlorella vulgarisandScenedesmus obliquus，and thep-nitrophenol(p-NP) toxicity to them at pH levels 7，8 and 9.The results showed that bothChlorella vulgarisandScenedesmus obliquuscould grow well at the range of pH 7-9，but the most suitable pH condition was different for each of them.Chlorella vulgarisgrew best at pH 8，whileScenedesmus obliquusgrew best at pH 9.The toxicity ofp-NP toChlorella vulgarisandScenedesmus obliquusdecreased with increasing pH，and the least toxic effectwas observed at pH 9.Thep-NP was more toxic toScenedesmus obliquusthanChlorella vulgaris，that is，Scenedesmus obliquuswas more sensitive to the toxicity ofp-NP thanChlorella vulgaris.Therefore，the influence of pH should be considered when an aquatic ecological criteria ofp-NP are selected.

Keywords:ecological criteria;p-nitrophenol;pH;Chlorella vulgaris;Scenedesmus obliquus

環(huán)境基準(zhǔn)是制定環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)基礎(chǔ)，決定著環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可靠性.為了進(jìn)一步完善和發(fā)展我國(guó)現(xiàn)有水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，迫切需求開(kāi)展系統(tǒng)、全面、科學(xué)的水環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)研究.

水質(zhì)基準(zhǔn)的制訂是以污染物對(duì)水生生物和人體健康的毒理學(xué)研究為基礎(chǔ)的［1］.水生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境因子，如pH，光照，溫度，鹽度，濁度和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等多種因素都會(huì)影響污染物在水環(huán)境中的物理、化學(xué)和生物過(guò)程，從而導(dǎo)致不同的生態(tài)效應(yīng)，影響污染物水環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)的制訂.環(huán)境因子與污染物之間對(duì)藻類毒性存在著交互作用，F(xiàn)RANKLIN等［2］的研究表明，不同pH條件下，銅和鈾對(duì)小球藻(Chlorellasp.)毒性不同;FAHL等［3］研究了滅草劑磺酰脲對(duì)綠藻(Chlorella fusca)的毒性與pH的關(guān)系.雖然在早期國(guó)外的研究中，已經(jīng)注意到了環(huán)境因素對(duì)污染物毒性的影響，但由于環(huán)境因子和生物種類等因素的地域特性，使水質(zhì)基準(zhǔn)也具有了地域特性.因此，在進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)，不能直接照搬現(xiàn)有的結(jié)果，應(yīng)該根據(jù)水生態(tài)類型的特點(diǎn)，從基礎(chǔ)性的工作做起.

對(duì)硝基酚(p-NP)水溶性高，易進(jìn)入水體，其主要通過(guò)染料生產(chǎn)、皮革加工、農(nóng)藥生產(chǎn)、空氣中硝基苯的光化學(xué)氧化、汽車尾氣排放和有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥的降解等途徑進(jìn)入環(huán)境中，美國(guó)部分水體中已達(dá)到了10-6，其在水體中的大量存在對(duì)水生生物造成了影響［4-5］.我國(guó)遼河流域ρ(p-NP)達(dá)到了8.929μg/L，底泥中的w(p-NP)達(dá)到了733.133μg/kg，并且在太湖流域水體中也已檢出p-NP［6］.p-NP是許多國(guó)家環(huán)境優(yōu)先監(jiān)測(cè)的污染物之一，也是我國(guó)提出的環(huán)境優(yōu)先監(jiān)測(cè)的6種酚類之一［7］.因此，有必要開(kāi)展p-NP的生態(tài)基準(zhǔn)研究.

筆者選擇太湖、遼河的優(yōu)勢(shì)種小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生柵藻 (Scenedesmus obliquus)為試驗(yàn)生物，研究不同pH(為7，8和9)下p-NP毒性效應(yīng)的變化，以期為水生態(tài)基準(zhǔn)方法學(xué)研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)后，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種進(jìn)行試驗(yàn).

人工氣候箱(SPX-400IC，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV755B，上海精密科學(xué)儀器有限公司);pH測(cè)定儀(ORP-431，上海大普儀器有限公司);無(wú)菌工作臺(tái)(JHK-A，天津市中環(huán)試驗(yàn)電爐有限公司);高壓滅菌鍋(HVE-50，日本HIRAYAMA公司);生物顯微鏡(HFX-Ц，日本Nikon公司)和血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司).

NaNO3，K2HPO4，MgSO4，CaCl2· 2H2O，Na2EDTA，Na2CO3，H3BO3，MnCl2·4H2O，ZnSO4· 7H2O，Na2MoO4·H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2· 6H2O，檸檬酸(C6H8O7)，檸檬酸鐵(FeC6H5O7· 5H2O)和對(duì)硝基酚(p-C6H5NO3)均為分析純，購(gòu)自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藻種的活化、培養(yǎng)與生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

試驗(yàn)參照OECD［8］標(biāo)準(zhǔn)方法，以 BG11［9］為培養(yǎng)基，8層無(wú)菌紗布封口，置于人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng).溫度為(25±2)℃，光強(qiáng)為3 000～4 000 lx，光暗比為12 h∶12 h，靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)搖動(dòng)3次，預(yù)培養(yǎng)3代.正式試驗(yàn)采用國(guó)際通用的“瓶法”，250 m L錐形瓶中接100 m L處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液(藻細(xì)胞密度為2×105mL-1).用表1所示通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定的p-NP系列濃度配制培養(yǎng)液，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行，然后根據(jù)太湖和遼河水體的實(shí)際pH范圍(7.25～9.00)［10-11］，選擇7，8和9為試驗(yàn)pH，用0.1 mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH分別為(7.0±0.2)，(8.0±0.2)和(9.0±0.2).

表1 試驗(yàn)采用的ρ(p－NP)Table 1 The mass concentrationp-NP in test

1.2.2 細(xì)胞密度測(cè)定與相對(duì)抑制率計(jì)算

采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定藻細(xì)胞密度，并同時(shí)于680 nm處測(cè)定其光密度，建立光密度與藻細(xì)胞密度的關(guān)系曲線，用以表征生物量.小球藻和斜生柵藻的光密度-藻細(xì)胞密度關(guān)系曲線分別為:

式中，x為光密度;y為藻細(xì)胞密度，104m L-1.

測(cè)定培養(yǎng) 96 h后藻液光密度，并根據(jù)OECD［8］計(jì)算對(duì)照組和測(cè)試組比生長(zhǎng)率(μC和μT)及二者比值(μT/μC).

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0的方差分析和LSD檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析和多重比較(P≤0.05差異顯著)，求出無(wú)可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)和最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC);進(jìn)行Probit分析，得到96 h半抑制濃度(EC50)及其95%置信區(qū)間(95%C. L.);繪圖采用Origin 8.0軟件.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH下小球藻和斜生柵藻的生長(zhǎng)狀況

圖1為不同pH下小球藻和斜生柵藻空白組的96 h比生長(zhǎng)率.如圖1所示，同一pH下，斜生柵藻的生長(zhǎng)速率明顯高于小球藻.但2種藻在不同pH下的生長(zhǎng)速率均不同.

圖1 不同pH下小球藻和斜生柵藻的比生長(zhǎng)率Fig.1 Specific growth rate ofChlorella vulgarisandScenedesmus obliquusat different pH

小球藻在pH為7，8和9時(shí)的比生長(zhǎng)率分別為0.48，0.52和 0.46，經(jīng)一維方差分析，pH為 8時(shí)的比生長(zhǎng)率明顯高于其他pH(P＜0.05)，而在pH為7和9時(shí)的差異不顯著(P＞0.05).斜生柵藻在pH為7，8和9時(shí)的比生長(zhǎng)率分別為0.65，0.67和0.69，其中pH為9時(shí)的比生長(zhǎng)率顯著高于pH為7(P＜0.05)，但pH在7～8和8～9的差異均不顯著(p＞0.05).綜上，小球藻最適生長(zhǎng)pH為8，斜生柵藻為9.

2.2 不同pH下p-NP對(duì)小球藻的毒性影響

圖2為不同 pH下小球藻比生長(zhǎng)率比值與p-NP的濃度-效應(yīng)關(guān)系.如圖2所示，在3個(gè)pH下，小球藻的比生長(zhǎng)率比值都隨著ρ(p-NP)的增加而降低，但不同pH下ρ(p-NP)對(duì)小球藻的毒性又存在差異.

圖2 不同pH下小球藻96 h比生長(zhǎng)率比值與ρ(p－NP)的關(guān)系Fig.2 Dose-effect relationship between specific grow th rate ofChlorella vulgarisand natural log ofp-NPmass concentration at different pH

通過(guò) SPSS 13.0軟件進(jìn)行多因素方差分析(ANOVA).結(jié)果表明，pH在7～8差異不顯著(P＞0.05)，其EC50分別為27.19和27.62 mg/L (見(jiàn)表2).但當(dāng)ρ(p-NP)較低(≤18.00 mg/L)時(shí)，小球藻在pH為8時(shí)較敏感，其LOEC為1.80 mg/L.pH為 9時(shí)p-NP的毒性明顯降低，其LOEC和EC50分別為 42.0和 47.71 mg/L，經(jīng)ANOVA分析表明，其毒性顯著低于pH為7和8 (P＜0.05).

2.3 不同pH下p-NP對(duì)斜生柵藻的毒性影響

圖3為不同pH下斜生柵藻比生長(zhǎng)率比值與p-NP的濃度關(guān)系.如圖3所示，3個(gè)pH下，斜生柵藻的比生長(zhǎng)率都隨著ρ(p-NP)的增大而顯著降低，但不同pH間ρ(p-NP)對(duì)斜生柵藻的毒性又有差異.

通過(guò) SPSS13.0軟件進(jìn)行多因素方差分析(ANOVA)，結(jié)果表明，3個(gè)pH下的p-NP的毒性差異顯著(p＜0.05)，但均隨著pH的升高而降低. pH為7，8和9時(shí)，對(duì)應(yīng)的EC50分別為6.89，10.84和22.56 mg/L(見(jiàn)表3).pH為7時(shí)斜生柵藻最敏感，其LOEC為1.0 mg/L，而pH為9時(shí)毒性最小.

表2 不同pH下小球藻的96 h NOEC，LOEC和EC50(95%C.L.)

Table 2 96 hNOEC，LOECandEC50(95%C.L.)ofChlorella vulgarisat different pH

測(cè)試終點(diǎn)ρ(p-NP)/(mg/L) pH=7 pH=8 pH=9 NOEC/(mg/L)1.80 0.56 32.00 LOEC/(mg/L) 5.60 1.80 42.00 EC50(95%C.L.)/(mg/L) 27.19(25.58～28.78) 27.62(23.96～31.32) 47.71(43.36～53.37)

表3 不同pH下斜生柵藻的96 h NOEC，LOEC和EC50(95%C.L.)Table 3 96 hNOEC，LOECandEC50(95%C.L.)Scenedesmus obliquusof at different pH

圖3 不同pH下斜生柵藻96 h比生長(zhǎng)率比值與p－NP的濃度－效應(yīng)關(guān)系Fig.3 Dose-effect relationship between specific growth rate ofScenedesmus obliquusand natural log ofp-NP concentration at different pH

3 討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)酚類的生態(tài)毒理學(xué)研究已經(jīng)將近25年，并且已對(duì)pH與酚類毒性的關(guān)系及機(jī)理進(jìn)行了研究［12-15］.HOWE等［16］研究了不同 pH下硝基酚類對(duì) 虹 鱒 魚(yú) (Oncorhynchus mykiss)和 糠 蝦(Gammarus pseudoltmnaeus)的毒性，結(jié)果表明，在12℃，pH為6.5和9.5時(shí)，p-NP對(duì)虹鱒魚(yú)的96 hLC50分別為3.80和78.90 mg/L，對(duì)糠蝦96 hLC50分別為 2.80和 42.50 mg/L;2，4-二硝基酚(2，4-DNP)在上述條件下，對(duì)虹鱒魚(yú)的96 hLC50分別為0.39和27.10 mg/L，對(duì)糠蝦96 hLC50分別為0.60和25.60 mg/L.pH為9.5時(shí)的毒性顯著低于pH為6.5時(shí)的毒性.CRONIN等［14］通過(guò)對(duì)包括鄰硝基酚(o-NP)和間硝基酚(m-NP)在內(nèi)的11種酚類在不同 pH下對(duì)大型溞(Daphnia magna)的毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，其EC50隨pH增大而增大.NALEZCZ等［17］研究了NPs對(duì)發(fā)光菌(Vibrio fischeri)在不同 pH下的毒性，根據(jù)其15 minEC50結(jié)果顯示，試驗(yàn)選用的幾種 NPs的毒性均隨pH的增大而減小.于瑞蓮等［18］的研究也得到了相一致的結(jié)果.這些與筆者所研究的不同pH下ρ(p-NP)對(duì)小球藻和斜生柵藻的毒性結(jié)果基本一致.

pH會(huì)改變?nèi)跛嵝曰蛉鯄A性有機(jī)物的解離度和辛醇-水分配系數(shù)(KOW)等性質(zhì).硝基酚為弱酸性有機(jī)物，當(dāng) pH增大時(shí)，其離子化程度升高.分子態(tài)更易穿過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入胞內(nèi)，因而毒性更大，該理論已得到普遍認(rèn)可［19-21］.也有學(xué)者認(rèn)為，由于pH升高改變了酚類的lgKOW，從而使其脂溶性降低，對(duì)其生物濃縮或累積產(chǎn)生影響，并且 pH對(duì)酚類毒性的影響主要是由于 pH會(huì)影響酚類生物累積性所致［15-16，22-24］.FISHER 等［22］的研究證實(shí)了上述論斷，在10℃，pH為6.5，7.5和8.5時(shí)，五氯酚(PCP)對(duì)斑馬貝(Dreissena polymorpha)的生物濃縮系數(shù)(BCF)分別為1 194，613和429. NEWSTED等［23］的研究表明，不同 pH時(shí)，苯酚在羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)體內(nèi)的生物濃縮系數(shù)(BCF)不同，并且當(dāng)pH在4.0～10.0變化時(shí)，BCF先增大后減小.HOWE等［16］的研究還表明，p-NP和2，4-DNP對(duì)虹鱒魚(yú)和糠蝦的BCF均隨pH增大而減小.KISHINO等［15］研究了不同pH條件下PCP對(duì)金魚(yú)的毒性和體內(nèi)累積性之間的關(guān)系，結(jié)果表明，pH為5.5～10.0時(shí)，PCP的毒性和生物累積性都降低，并且其5 hLC50與暴露在0.1 mg/L PCP下的5 h lgBCF之間有很好的相關(guān)性.

從該研究的結(jié)果看，雖然在試驗(yàn)的 pH范圍內(nèi)，小球藻和斜生柵藻都可以正常生長(zhǎng)，但其生長(zhǎng)最適的pH不同，小球藻為8，而斜生柵藻為9，這與已有的研究結(jié)果一致［25-26］.大量研究［25-30］表明，每種藻都有各自最適生長(zhǎng)的 pH范圍，這主要是由于不同藻類自身的生理差異造成的.這種差異還影響了不同藻對(duì)污染物的敏感性和耐受性，該研究中小球藻和斜生柵藻對(duì)p-NP的敏感性(LOEC)和耐受性(EC50)不同.斜生柵藻比小球藻敏感，小球藻在 pH為8時(shí)敏感性最好，斜生柵藻在pH為7時(shí)最敏感.而小球藻的耐受性強(qiáng)，其EC50為斜生柵藻的2～4倍，但二者均在 pH為9時(shí)耐受性最大.陳傳平等［31］研究苯胺和苯酚對(duì)淡水藻類生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一毒物濃度下，斜生柵藻比蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)表現(xiàn)得更為敏感.SABATER等［32］的研究表明，氯黃隆對(duì)柵藻和小球藻96 h的EC50分別為0.22和54.0 mg/L，即柵藻更敏感.

污染物對(duì)生物的毒性是環(huán)境因子、污染物和受試生物三者之間共同作用的結(jié)果.該研究的結(jié)果表明，小球藻最適生長(zhǎng)pH為8，并且此時(shí)對(duì)p-NP最敏感;而斜生柵藻最適生長(zhǎng)pH為9，卻在pH為7時(shí)最敏感;但這2種藻對(duì)p-NP的耐受性都隨著pH的增大而增大.也研究了相同試驗(yàn)條件下，Cr6+對(duì)小球藻和斜生柵藻的毒性，結(jié)果表明，小球藻和斜生柵藻均在其最適生長(zhǎng)pH時(shí)，對(duì)Cr6+的耐受性最強(qiáng)(另文討論).不同pH下藻的生長(zhǎng)狀況對(duì)Cr6+的毒性有顯著影響，而生長(zhǎng)狀況對(duì)p-NP毒性的影響不明顯，這表明pH對(duì)p-NP存在形態(tài)的作用是造成其對(duì)p-NP毒性影響的主要因素.

研究表明，p-NP的毒性效應(yīng)確實(shí)受pH的影響.因此，在進(jìn)行p-NP生態(tài)基準(zhǔn)相關(guān)研究時(shí)，pH是一個(gè)重要的影響因素，甚至要考慮在區(qū)域環(huán)境可能的pH范圍內(nèi)，根據(jù)不同的pH制訂不同的基準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)值.除 pH外，光照、溫度和鹽度等環(huán)境因子也都有可能會(huì)影響p-NP的毒性，因此，進(jìn)行生態(tài)基準(zhǔn)研究時(shí)，應(yīng)該首先篩選出對(duì)污染物毒性產(chǎn)生影響的重要環(huán)境因子.該試驗(yàn)僅從藻類種群水平研究了pH對(duì)p-NP毒性的影響，還需要進(jìn)一步從群落水平以至生態(tài)系統(tǒng)水平進(jìn)行研究.

4 結(jié)論

a.藻種不同所適應(yīng)的生長(zhǎng)環(huán)境條件也不同，在該試驗(yàn)條件下，小球藻的最適 pH為8，而斜生柵藻的最適pH是9.

b.pH在7～9下，p-NP對(duì)斜生柵藻和小球藻的毒性效應(yīng)均隨pH而變化，pH為9時(shí)毒性最小.p-NP對(duì)斜生柵藻的毒性比對(duì)小球藻大，即斜生柵藻對(duì)p-NP比小球藻更敏感.

c.pH影響p-NP毒性變化的主要原因可能是其對(duì)p-NP化學(xué)形態(tài)的作用.

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Toxicity of p-NP on Chlorella vulgaris and Scenedesm us obliquus at different pH leve ls

FENG Ming-feng1，2，ZHAO Na1，WANG Ke1，WANG Lin-tong1，ZHU Lin1

1.Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria，Ministry of Education，College of Environmental Science and Engineering，Nankai University，Tianjin 300071，China
2.Tianjin Academy of Environmental Sciences，Tianjin 300071，China

X171.5

A

1001-6929(2011)02-0210-06

2010-05-07

2010-10-29

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2008ZX08526-003)

馮 鳴 鳳 (1984 -)， 女， 河 北 邢 臺(tái) 人，m ff840621@163.com.

*責(zé)任作者，朱琳(1957-)，男，山東濟(jì)南人，教授，博士，博導(dǎo)，主要從事生態(tài)毒理學(xué)研究，zhulin@nankai.edu.cn