趙志剛，張志生，程 杰，陳傳斌，高士祥

南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046

大型溞母溞暴露于氨氮所產(chǎn)子代對(duì)氨氮毒性的耐受性

趙志剛，張志生，程 杰，陳傳斌，高士祥*

南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046

采用大型溞(Daphnia magna)作為受試生物，在測(cè)定了氨氮對(duì)大型溞的急慢性毒性效應(yīng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了在慢性毒性試驗(yàn)中暴露于氨氮環(huán)境下的母溞所產(chǎn)子代對(duì)氨氮的毒性響應(yīng).急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，氨氮對(duì)大型溞的24 h和48 h的LC50分別為165.97和69.54 mg/L.21 d慢性試驗(yàn)結(jié)果表明:大型溞的生長(zhǎng)指標(biāo)——脫皮數(shù)是對(duì)氨氮最為敏感的毒性參數(shù);其慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL)分別為1.88和3.75 mg/L;據(jù)此計(jì)算出的慢性毒性值(CHV)為2.66 mg/L，急慢性比(ACR)為26.14.在慢性試驗(yàn)中，暴露于毒物的母體所產(chǎn)的子代幼溞，與對(duì)照組相比，其48 hLC50都有所增大(增幅為13.7%～56.2%)，說(shuō)明對(duì)毒物的適應(yīng)性有所增強(qiáng).

氨氮;大型溞;急性毒性;慢性毒性;子代

Abstract:The acute and chronic toxicity effects of ammonia nitrogen were studied usingDaphnia magnaas the test organism.The toxicity response of the offspring born by pregnant individuals during chronic exposure to ammonia nitrogen was further studied.The acute toxicity test showed that the 24 hLC50and 48 hLC50of ammonia nitrogen to this organism were 165.97 and 69.54 mg/L，respectively.The results of 21 d chronic toxicity testing showed that the number of exuviations，one of the grow th parameters，was the most sensitive indicator，from which the values of Lower Chronic Limit(LCL)and Upper Chronic Limit(UCL)were determined to be 1.88 and 3.75 mg/L，respectively.The Chronic Value(CHV)was calculated as 2.66 mg/L using theLCLandUCL.A ll the data allowed us to obtain the Acute-to-Chronic Ratio(ACR)as 26.14.In contrastwith the control，the 48 hLC50of ammonia nitrogen to the offspring born by the pregnant individual during the chronic test exposure were greater(increased by 13.7%-56.2%)，which suggested thatmaternal exposure to ammonia nitrogen could improve the adaptability of the offspring to the same chemical.

Keywords:ammonia nitrogen;Daphnia magna;acute toxicity;chronic toxicity;offspring

隨著我國(guó)工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，氨氮已經(jīng)成為全國(guó)性首要污染.2008年重點(diǎn)流域水污染考核結(jié)果顯示，氨氮已超過(guò)化學(xué)需氧量(COD)成為影響地表水水環(huán)境質(zhì)量的首要指標(biāo).水中氨氮主要來(lái)源于生活污水中含氮有機(jī)物受微生物作用的分解產(chǎn)物、工業(yè)廢水以及農(nóng)業(yè)面源.研究［1］表明，水中氨氮可降低魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)和軟體動(dòng)物的能量代謝活動(dòng)，損害其鰓、肝、腎、脾和甲狀腺組織，并可降低動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白輸氧的能力，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡.在溶液中總銨由處于平衡態(tài)的非離子氨(NH3)和離子銨)2種形式組成.二者比例主要取決于 pH和其他一些因素.非離子氨 NH3是非極性化合物，有較大的脂溶性，能穿透細(xì)胞膜毒害組織.因此，非離子氨的毒性比離子銨大得多［2］.

水溞是世界范圍內(nèi)廣泛分布的枝角類(lèi)無(wú)脊椎動(dòng)物，已被廣泛應(yīng)用于污染物的毒性研究［3-7］.這主要是由于其對(duì)污染物非常敏感.大型溞(Daphnia magna)是一種重要的水溞代表種.目前對(duì)大型溞已有許多研究，但有關(guān)暴露于污染物中的母溞所產(chǎn)幼溞對(duì)污染物的耐受性還鮮見(jiàn)報(bào)道.筆者在研究了氨氮對(duì)大型溞急性和慢性毒性的基礎(chǔ)上，對(duì)在慢性毒性試驗(yàn)中母溞所產(chǎn)幼溞的急性毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為了解氨氮對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和推導(dǎo)保護(hù)我國(guó)水生生物的氨氮水質(zhì)基準(zhǔn)值提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

大型溞為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以斜生柵藻培養(yǎng)的同一母溞所產(chǎn)、培養(yǎng)3代以上的幼溞.

氯化銨(分析純，含量＞99.5%)購(gòu)于南京化學(xué)試劑廠.

儀器主要包括電子天平〔BS124S，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司〕，智能光照培養(yǎng)箱(LRH-250-Gb，廣東韶關(guān)鑫騰科普儀器有限公司)，連續(xù)變倍體視顯微鏡(XTZ-E，上海立光精密儀器有限公司)，精密pH計(jì)〔PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司〕，溶氧儀(LIDA820，上海理達(dá)儀器廠)和電導(dǎo)率儀(CONscan30，上海理達(dá)儀器廠)等.

試驗(yàn)用水為活性炭過(guò)濾并充氧曝氣48 h以上的自來(lái)水，試驗(yàn)前于培養(yǎng)箱中平衡2 h.平衡后水溫為(22±1)℃，pH為7.9～8.0，ρ(溶解氧)＞5 mg/L，電導(dǎo)率為(285±20)μS/cm，總硬度為(118.5±4.2)mg/L(以CaCO3計(jì)).

1.2 大型溞急性毒性試驗(yàn)

取溞齡為6～24 h的新生幼溞，參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)標(biāo)準(zhǔn)方法［8］進(jìn)行試驗(yàn).先將氯化銨用蒸餾水配制成高濃度母液，再用水稀釋至設(shè)定濃度.先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以確定正式試驗(yàn)濃度設(shè)定范圍.正式試驗(yàn)中按幾何級(jí)數(shù)濃度系列設(shè)置6個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照.由于轉(zhuǎn)移大型溞時(shí)會(huì)夾帶部分水，配制某濃度溶液時(shí)均分為A和B 2份，先將大型溞移至A液再移至B液中進(jìn)行試驗(yàn)，以盡可能減少水對(duì)溶液的稀釋.每個(gè)容器中放5只幼溞(滿足生物量≥2 m L/只)，每個(gè)濃度共20只.試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為:光暗比 16 h∶8 h，光強(qiáng)為2 000 lx，(22±1)℃.試驗(yàn)期間不喂食，持續(xù)48 h.試驗(yàn)終點(diǎn)為死亡，即在體視鏡下觀察其心臟停止跳動(dòng).

1.3 大型溞慢性毒性試驗(yàn)

慢性毒性試驗(yàn)按照 OECD標(biāo)準(zhǔn)方法［9］進(jìn)行.試驗(yàn)容器為9 cm培養(yǎng)皿，試液體積為50 m L，每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)放入1只溞齡小于24 h的新生健康幼溞，加蓋以防止受試液揮發(fā).根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置慢性毒性受試濃度組6組，每組6個(gè)平行.同時(shí)設(shè)一對(duì)照組.其中最高濃度組低于急性毒性LC50值.采用靜態(tài)更新試液法，每隔一天更新一次受試液.并加入一滴綠藻濃縮液〔斜生柵藻(Scenedesmaceae obliquus)〕，使試液中藻細(xì)胞密度達(dá)50×104m L-1以上，以喂食大型溞.試驗(yàn)持續(xù)21 d，每天觀察記錄大型溞存活、脫殼、生長(zhǎng)、懷孕和產(chǎn)仔情況.考察指標(biāo)有:7 d體長(zhǎng)，21 d體長(zhǎng)，脫殼數(shù)，首次懷孕時(shí)間，首次產(chǎn)卵時(shí)間，首胎產(chǎn)卵量和每只母溞生殖期所產(chǎn)幼溞總數(shù)(平均值)等.

1.4 慢性子代急性毒性試驗(yàn)

在大型溞慢性毒性試驗(yàn)中，當(dāng)母溞進(jìn)入產(chǎn)卵高峰期時(shí)，搜集每個(gè)處理組懷孕母溞同一天所產(chǎn)且非第一代幼溞，用于測(cè)定氨氮對(duì)其的急性毒害.試驗(yàn)方法同1.2節(jié)，考察受試子代對(duì)氨氮暴露的適應(yīng)性變化.

1.5 質(zhì)量保證

為保證試驗(yàn)結(jié)果的有效性，同時(shí)測(cè)定重鉻酸鉀對(duì)大型溞的24 hEC50值，為0.7 mg/L，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求 (0.5～1.2 mg/L).整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中ρ(溶解氧)＞5 mg/L.對(duì)照組沒(méi)有抑制現(xiàn)象.在試驗(yàn)過(guò)程中采用納氏試劑分光光度法測(cè)定了受試液中氨氮實(shí)際含量，ρ()占設(shè)定濃度的85.0% ～109.3%，在 ±20%范圍內(nèi)，因此試驗(yàn)采用設(shè)定濃度而未加以修正.

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有處理組數(shù)據(jù)用單樣本 K-S檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布. 急性LC50值是根據(jù) Trimmed Spearman-Karber統(tǒng)計(jì)分析方法，使用 Trimmed Spearman-Karber(TSK)Program Version1.5［10］計(jì)算.慢性數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)分析軟件 SPSS16.0 for Windows分析各種指標(biāo)與對(duì)照組差異，以獲得受試物對(duì)大型溞的慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL).然后根據(jù)這2個(gè)值求其幾何平均值得到受試物慢性毒性值(CHV)，并由此得到急慢性比(ACR).

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氮對(duì)大型溞的急性毒性效應(yīng)

氨氮對(duì)大型溞的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 1.對(duì)照組在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，死亡率為0.由于氨氮對(duì)大型溞急性毒害范圍較大，死亡率隨時(shí)間變化很劇烈，24 h時(shí)150.00 mg/L濃度組死亡率只有15%，而到了48 h則全部死亡.因此分2組進(jìn)行試驗(yàn)，以便分別測(cè)定24 h和48 hLC50.24 h和48 h的毒性效應(yīng)結(jié)果經(jīng)單樣本K-S檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布(P＞0.05).采用TSK程序計(jì)算氨氮對(duì)大型溞的24 hLC50為165.97 mg/L，而48 hLC50為69.54 mg/L.由此可知，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，大型溞體質(zhì)明顯下降，對(duì)氨氮的耐受能力也大大減弱.推測(cè)原因是氨氮降低了大型溞的能量代謝活動(dòng)，并使其呼吸困難，體內(nèi)輸氧能力減弱導(dǎo)致供氧不足而死亡.試驗(yàn)過(guò)程中觀察到暴露于氨氮中的大型溞有大量脫皮，游動(dòng)能力和頻率隨時(shí)間的持續(xù)而顯著降低.高濃度組則靜止，僅在搖動(dòng)容器時(shí)有微弱擺動(dòng)，暴露一定時(shí)間即死亡.在整個(gè)試驗(yàn)中，大型溞運(yùn)動(dòng)受抑制數(shù)(EC)與死亡數(shù)(LC)相差不大.

表1 氨氮對(duì)大型溞的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The acute toxicity results of ammonia toD.magna

2.2 氨氮對(duì)大型溞的慢性毒性效應(yīng)

氨氮對(duì)大型溞的慢性毒性試驗(yàn)中各毒性指標(biāo)隨氨氮濃度的變化見(jiàn)表2.在21 d慢性毒性試驗(yàn)期間，對(duì)照組及各處理組中均沒(méi)有個(gè)體死亡.與對(duì)照組相比，各處理組首次懷孕時(shí)間和首次產(chǎn)卵時(shí)間均有所增大.這與 EBERT［11］報(bào)道的毒物會(huì)延遲大型溞種群開(kāi)始繁殖時(shí)間的現(xiàn)象一致.但是可能由于試驗(yàn)所設(shè)濃度的局限性等原因，這種差異性并不顯著(P＞0.05).隨著暴露濃度的增加，首胎產(chǎn)卵量略微增加，后又有所下降，ρ()達(dá)30.00 mg/L時(shí)，首胎產(chǎn)卵量與對(duì)照組相比增加了46%.平均每只母溞總產(chǎn)卵量除了7.50和15.00 mg/L的濃度組與對(duì)照組相比有顯著降低之外，其余各組均沒(méi)有顯著變化.對(duì)于該原因還需進(jìn)一步研究探討.每只母溞21 d的脫皮數(shù)與其他指標(biāo)相比，是一個(gè)較好的指標(biāo).各濃度組與對(duì)照組相比均有所降低，ρ()達(dá)3.75 mg/L及以上者均有顯著降低. 說(shuō)明氨氮能抑制大型溞的脫皮. SMART［1］的研究表明，水中氨氮可降低水生生物的能量代謝活動(dòng)，損害其各種器官組織.推測(cè)氨氮抑制大型溞脫皮的機(jī)理可能與此有關(guān).

由表2可知，在考察濃度范圍內(nèi)，7 d體長(zhǎng)、首次懷孕時(shí)間、首次產(chǎn)卵時(shí)間和21 d體長(zhǎng)等4個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組在0.05顯著性水平上相比沒(méi)有顯著差異;首胎產(chǎn)卵量、每只母溞總產(chǎn)卵量和脫皮數(shù)等3個(gè)指標(biāo)則有顯著性差異，說(shuō)明是敏感指標(biāo)，其中最敏感的指標(biāo)是脫皮數(shù).由首胎產(chǎn)卵量、每只母溞總產(chǎn)卵量和脫皮數(shù)3個(gè)指標(biāo)得出慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL)列于表3.

由脫皮數(shù)指標(biāo)得出氨氮對(duì)大型溞的LCL和UCL分別為1.88和3.75 mg/L.取二者幾何平均值即氨氮對(duì)大型溞的CHV為2.66 mg/L，該值與急性48 hLC50之比得到ACR為26.14.

大型溞慢性毒性試驗(yàn)一般進(jìn)行21 d暴露，但是有研究［12-13］指出:在進(jìn)行大型溞慢性毒性試驗(yàn)時(shí)，大型溞早期(7～8 d)體長(zhǎng)變化對(duì)環(huán)境因子較敏感，并提出以其早期的體長(zhǎng)為試驗(yàn)指標(biāo)，可以縮短試驗(yàn)周期.GEIGER等［14］也指出，水溞出生后的7 d內(nèi)，其生長(zhǎng)受抑制可能是動(dòng)物慢性試驗(yàn)的良好指標(biāo).因此，筆者選擇7 d體長(zhǎng)作為考察指標(biāo)，以驗(yàn)證該結(jié)論.但是試驗(yàn)結(jié)果表明，7 d體長(zhǎng)指標(biāo)對(duì)于衡量氨氮對(duì)大型溞的毒害并不是敏感指標(biāo).因此，該指標(biāo)的推廣和應(yīng)用還需慎重考慮.另外，一些研究［15-17］指出，生殖指標(biāo)是大型溞最敏感的指標(biāo).筆者所選的3個(gè)敏感指標(biāo)中前2個(gè)即是生殖指標(biāo)，說(shuō)明對(duì)于衡量氨氮的毒性，生殖指標(biāo)確是較敏感的指標(biāo).但從慢性試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，脫皮數(shù)作為衡量大型溞生長(zhǎng)情況的指標(biāo)，對(duì)于考察氨氮的毒性卻是最敏感的.這些現(xiàn)象充分說(shuō)明了大型溞的各生物學(xué)指標(biāo)不僅對(duì)同一種藥劑的敏感性有所差別，對(duì)不同藥劑的反應(yīng)模式也有所不同［18］.

表2 氨氮對(duì)大型溞的慢性毒性數(shù)據(jù)Table 2 The chronic toxicity of ammonia toD.magna

表3 氨氮對(duì)大型溞的慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The chronic toxicity results of ammonia toD.magna

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，氨氮對(duì)大型溞的48 hLC50為69.54 mg/L，按照化學(xué)物質(zhì)對(duì)水生生物的急性毒性分級(jí)［19］，屬于低毒.但是其慢性毒性下限值為1.88 mg/L.說(shuō)明氨氮對(duì)水生生物的長(zhǎng)期慢性毒害不容忽視.

2.3 氨氮對(duì)慢性受試母溞所產(chǎn)子代的急性毒性效應(yīng)

氨氮對(duì)慢性試驗(yàn)中受試母溞所產(chǎn)子代的急性毒性效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖1.

在慢性試驗(yàn)中，暴露于毒物的母體所產(chǎn)的子代幼溞，與對(duì)照組相比，其 48 hLC50都有所增大(增幅為13.7%～56.2%).暴露于30.00 mg/L濃度組的母溞所產(chǎn)幼溞的 48 hLC50增至 108.62 mg/L，為對(duì)照組的156.2%.說(shuō)明出生于毒物暴露環(huán)境中的幼溞，對(duì)毒物的適應(yīng)性都有增強(qiáng)，且在受試濃度范圍內(nèi)有上升的趨勢(shì)，ρ()為30.00 mg/L組的耐受性最強(qiáng).EBERT［11］報(bào)道，毒物會(huì)延遲大型溞種群開(kāi)始繁殖的時(shí)間，但是，當(dāng)外界環(huán)境中污染物消失時(shí)，因受毒物影響延遲繁殖的母溞所生后代將會(huì)存活得更長(zhǎng)并生長(zhǎng)得更快.這說(shuō)明大型溞對(duì)暴露毒物已經(jīng)產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性. MUNZINGER等［20］也曾研究了鎳對(duì)大型溞7代的影響，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期在毒物中生存的大型溞由于產(chǎn)生了適應(yīng)性，其內(nèi)稟增長(zhǎng)率有所增加.對(duì)于可能在生物體內(nèi)積累的毒物，還需要進(jìn)一步研究毒物是否從母代遺傳到子代，并且找到這種現(xiàn)象的原因，探討母代受污染后所產(chǎn)生的子代在生理學(xué)及能力方面的變化等問(wèn)題也將具有重要的生物學(xué)意義.

圖1 慢性試驗(yàn)中暴露于各處理組母溞所產(chǎn)子代48 h LC50值Fig.1 The 48 hLC50ofD.magnaoffspring born in each concentration of the chronic test

3 結(jié)論

a.氨氮對(duì)大型溞的 24 hLC50為 165.97 mg/L，48 hLC50為69.54 mg/L.按照化學(xué)物質(zhì)對(duì)水生生物的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于低毒.

b.在氨氮暴露環(huán)境中，大型溞的首胎產(chǎn)卵量、每只母溞總產(chǎn)卵量和脫皮數(shù)3個(gè)指標(biāo)為敏感指標(biāo).由此得到氨氮對(duì)大型溞的LCL和UCL分別為1.88和 3.75 mg/L，CHV為 2.66 mg/L，ACR為26.14.氨氮對(duì)大型溞的長(zhǎng)期慢性毒害不容忽視.

c.在慢性毒性試驗(yàn)中，暴露于氨氮的母溞所產(chǎn)的子代幼溞對(duì)氨氮的適應(yīng)性都有增強(qiáng)，且在受試濃度范圍內(nèi)有增大趨勢(shì).

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Acute Toxicity o f Amm onia to O ffsp ring o f Daphnia m agna Born by Pregnant Individua ls During Chronic Exposure

ZHAO Zhi-gang，ZHANG Zhi-sheng，CHENG Jie，CHEN Chuan-bin，GAO Shi-xiang
State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，School of the Environment，Nanjing University，Nanjing 210046，China

X171.5

A

1001-6929(2011)02-0205-05

2010-06-19

2010-11-05

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2008ZX08526-003);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2007AA06A405)

趙 志 剛 (1987 -)， 男， 山 東 臨 沂 人，xiaogang540@126.com.

*責(zé)任作者，高士祥(1962-)，男，江蘇揚(yáng)州人，教授，博士，博導(dǎo)，主要從事污染生態(tài)化學(xué)研究，ecsxg@nju.edu.cn