劉計(jì)權(quán)，謝樹(shù)蓮，尹曉琴，蘇志蘭

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原 030024； 2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

犬問(wèn)荊Equisetum palustre Linn為木賊科問(wèn)荊屬藥用植物［1］，據(jù)文獻(xiàn)資料報(bào)道，問(wèn)荊屬中藥用植物的主要成分為黃酮醇及二氫黃酮醇類，如山奈素、槲皮素、二氫槲皮素等［2］。藥理研究顯示，該類成分具有抗心肌缺血、降血壓、鎮(zhèn)靜、以及抗腫瘤、抗癌等作用，且可作為清肝明目、鎮(zhèn)痛止血藥作為戒毒藥品［3-4］。犬問(wèn)荊廣泛分布于全國(guó)各地，本實(shí)驗(yàn)以山奈素為指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)法對(duì)犬問(wèn)荊山奈素提取中的水解條件進(jìn)行了優(yōu)選。

1 實(shí)驗(yàn)材料

Waters高效液相色譜儀（515泵，2996紫外檢測(cè)器）。山奈素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110861-200808）；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，磷酸為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純。犬問(wèn)荊采自內(nèi)蒙赤峰，經(jīng)鑒定為木賊科問(wèn)荊屬藥用植物犬問(wèn)荊Equisetum palustre Linn。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取犬問(wèn)荊0.75 g粉末過(guò)三號(hào)篩，共9份，置于具塞圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷后稱定重量，用75%乙醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻?yàn)V過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 mL加濃鹽酸進(jìn)行水解［5］。水解液于水浴中蒸干，殘?jiān)诱麴s水10 mL溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，水浴揮干溶劑，殘?jiān)右掖既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻作為供試品溶液。

2.2 水解條件的正交設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)［6］，選用L9（34）正交表對(duì)水解條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，選用加濃鹽酸體積、水解溫度、水解時(shí)間3項(xiàng)作為考察因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，各因素水平見(jiàn)表1。

2.3 山奈素的測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Sinochorm-ODS BP色譜柱（250 nm×4.6 nm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（56∶44）；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm。山奈素對(duì)照品和犬問(wèn)荊供試品HPLC色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

表1 山奈素水解條件因素水平表

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取山奈素對(duì)照品5.7 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液（含山奈素0.114 mg/mL）。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置 10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；分別吸取10 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以山奈素進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，計(jì)算得回歸方程為Y=4 636.2X－47 562，r=0.999 9。結(jié)果表明：山奈素在 0.057 μg～1.140 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 樣品含量測(cè)定

精密吸取上述供試品溶液10 μL分別注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定，帶入回歸方程計(jì)算山奈素的含量。測(cè)定結(jié)果及結(jié)果分析見(jiàn)表2、表3。

從表2可以看出，不同因素水平對(duì)結(jié)果影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋篈1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，D2＞D1＞D3，從而初步認(rèn)為最佳水解條件為A1B2D2。為進(jìn)一步明確各因素的水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有顯著影響，利用方差分析作進(jìn)一步考察。由表3可知，F(xiàn)0.05＜FD＜F0.01，即因素D（加鹽酸量）的水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，因素A（水解時(shí)間）和因素B（水解溫度）的水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性影響。從節(jié)約的角度考慮，最終確定理想的水解條件為A1B1D2，即60℃下，加鹽酸2.5 mL，水解30 min。

表2 山奈素水解條件L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 山奈素水解條件方差分析表

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)所得的最佳水解條件，稱取同批犬問(wèn)荊3份，按最佳水解條件制備供試品溶液，在上述色譜條件下，精密吸取上述對(duì)照品溶液與各供試品溶液10 μL，對(duì)山奈素的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 犬問(wèn)荊中山奈素的含量測(cè)定結(jié)果 （n=3）

由表4可知，3次所測(cè)犬問(wèn)荊中山奈素的平均含量為0.057 7 mg/g，與最佳水解條件下所測(cè)的平均值相近，RSD為0.49%，說(shuō)明該方法穩(wěn)定、可行。

3 討 論

3.1 提取溶劑的考察

由于甲醇毒性大，故考慮能否用75%的乙醇代替75%甲醇作為提取溶劑，對(duì)兩者的提取效果進(jìn)行考察。結(jié)果以75%乙醇回流提取完全，所測(cè)目標(biāo)成分山奈素含量較高，且色譜圖中各峰分離效果好。由于乙醇較甲醇對(duì)人體危害小，故最終確定采用75%的乙醇作溶劑回流提取樣品。

3.2 樣品的純化處理

本品成分復(fù)雜，用乙醇作溶劑提取后，在主峰前有大量的極性組分，為了減小其他組分的干擾，故用乙酸乙酯對(duì)樣品進(jìn)行萃取，并且進(jìn)行萃取次數(shù)的考察，測(cè)定結(jié)果表明，用乙酸乙酯萃取3次即可提取完全。

3.3 流動(dòng)相的選擇

參考有關(guān)文獻(xiàn)，采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，比較不同比例的流動(dòng)相，結(jié)果以甲醇-0.4%磷酸溶液（56∶44）為流動(dòng)相山奈素與其相鄰的組分峰可獲得良好分離，且保留時(shí)間長(zhǎng)短適中［7-8］。

本研究獲得的最佳水解條件穩(wěn)定、可行，可用于犬問(wèn)荊中山奈素含量的提取測(cè)定，為犬問(wèn)荊的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

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