周 璐，王媛凱，張立偉

（山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，山西太原030006）

紅花為菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花瓣，為常用的活血化瘀中藥。紅花黃色素（SY）是紅花活血作用的主要有效部位，能夠改善心肌及腦組織微循環(huán)障礙，臨床上被大量應(yīng)用于冠心病和心絞痛的治療［1］。羥基紅花黃色素A（HSYA）和紅花黃色素B（SYB）是SY中含量較高的查耳酮類成分，也是SY發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)［2］。文獻(xiàn)報(bào)道，HSYA具有保護(hù)心腦［3-4］和拮抗血小板激活因子受體的作用，可明顯抑制血小板內(nèi)游離鈣離子濃度升高［5］；SYB可明顯抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠體外血小板聚集率并可延長大鼠凝血時(shí)間［6］。近來研究發(fā)現(xiàn)HSYA具有一定的抗氧化作用，可清除羥自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［7］。為了探討HSYA和SYB防治心血管疾病及抗氧化作用的機(jī)制，本文進(jìn)行了HSYA和SYB對(duì)外源O2-.所致紅細(xì)胞膜氧化損傷的保護(hù)作用的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 DPH探針（1，6-二苯基-1，3，5己三烯）為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，以四氫呋喃配成2 mmol/L溶液，裝入棕色瓶中置4℃冰箱中保存，臨用前用PBS稀釋成2×10-6mol/L；考馬斯亮藍(lán)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；鄰苯三酚購自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；維生素C為新鄉(xiāng)市常樂制藥有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。新鮮血液由山西大學(xué)校醫(yī)院提供。PBS緩沖液（10 mM）的配制：NaCl 125 mM，KCl 2.7 mM，Na2HPO48 mM，KH2PO41.5 mM，glucose 10 mM，pH 7.4。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 CR-22G型高速冷凍離心機(jī)（HITACHI公司）；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Cary-50Bio紫外可見分光光度計(jì)（美國瓦里安技術(shù)中國有限公司）；熒光光度計(jì)LS-50B（PE公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物的提取純化 HSYA、SYB的提取純化：紅花干燥粉末，加30倍水60℃提取2次，每次45 min，合并提取液，濾過，50℃減壓濃縮；將提取液過聚酰胺柱，水、30%乙醇、70%乙醇依次梯度洗脫，收集70%乙醇洗脫部分經(jīng)制備液相純化，得SYB純品；收集30%乙醇洗脫部分再經(jīng)反相柱材料MDS及制備液相純化，得HSYA純品。通過理化常數(shù)、化學(xué)方法及光譜數(shù)據(jù)（UV、IR、NMR、MS、CD 等）分析，鑒定了它們的結(jié)構(gòu)為 HSYA［8］及 SYB［9］。

1.2.2 紅細(xì)胞膜的制備 取新鮮健康人全血于1 000 r/min離心5 min，吸除上層白細(xì)胞及血小板，在洗凈的紅細(xì)胞中按照1∶40的比例加入預(yù)冷的5 mM pH

8.4 的PBS緩沖液，置于4℃冰箱中1 h，使之溶血。然后于4℃，15 000 r/min，離心30 min，離心后傾去離心管中的上層液體，下層品紅色沉淀反復(fù)洗滌至無色，最后懸浮于5 mM pH 8.4的PBS緩沖液中?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)膜蛋白含量，調(diào)蛋白濃度為400 mg/L。

1.2.3 氧化損傷紅細(xì)胞膜的制備 取制備好的紅細(xì)胞膜懸浮液，加入新鮮配制的鄰苯三酚溶液（終濃度為0.5 mM），混勻后37℃水浴 10 min，立即用6倍10 mM pH 7.4的PBS緩沖液洗滌并在4℃15 000 r/min離心10 min，沉淀即為氧化損傷紅細(xì)胞膜。

1.2.4 抗氧化損傷紅細(xì)胞膜的制備 取制備好的紅細(xì)胞膜懸浮液，加入不同濃度的HSYA和SYB，然后按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行，沉淀即為抗氧化損傷紅細(xì)胞膜。同時(shí)以加入VitC制備的抗氧化損傷紅細(xì)胞膜作為陽性對(duì)照。

1.2.5 HSYA和SYB對(duì)人紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響取已制備好的正常紅細(xì)胞膜、氧化損傷紅細(xì)胞膜和抗氧化損傷紅細(xì)胞膜各1 mL，每組4管，分別加入含DPH 為 2 μM/L 的 PBS（10 mM，pH 7.4）溶液 3 mL 混勻，于37℃孵育30 min。離心除去DPH標(biāo)記殘液，用PBS（10 mM，pH 7.4）緩沖液洗滌1次，最后懸浮在 4 mL PBS（10 mM，pH 7.4）緩沖液中，采用熒光偏振法檢測(cè)DPH熒光各向異性，激發(fā)波長為362 nm，發(fā)射波長為432 nm。熒光各向異性（r）根據(jù)公式（1）計(jì)算：

式中Iυυ和Iυh分別代表與激發(fā)偏振光振動(dòng)方向平行、垂直時(shí)的熒光偏振度，G 為校正因子（G=Ihυ/Ihh）。

表觀微黏度（η）根據(jù)公式（2）計(jì)算：

式中γ0為0.362。膜流動(dòng)性用膜表觀微黏度表示，γ值越大，η值越大，則膜流動(dòng)性越小，反之亦然。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行多組組間比較，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié) 果

HSYA和SYB對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響，結(jié)果見表1。

表1 HSYA和SYB對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響 （n=4）

由表1可見，氧化組與正常對(duì)照組比較，其熒光各向異性值明顯增大（P<0.01），即表觀微黏度值明顯增大（P<0.01），紅細(xì)胞膜流動(dòng)性明顯降低。而在膜制劑中預(yù)先分別加入了不同濃度的HSYA和SYB后再經(jīng)鄰苯三酚處理，其熒光各向異性值明顯降低（P<0.01），表觀微黏度明顯下降（P<0.01），紅細(xì)胞膜流動(dòng)性明顯增大，并且存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

細(xì)胞膜流動(dòng)性與細(xì)胞膜的能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、物質(zhì)交換等重要功能密切相關(guān)［10］，適宜的膜脂流動(dòng)性是維持生物膜正常功能的必要條件。大量事實(shí)證明，許多疾病與生物膜脂的流動(dòng)性變化有關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂、糖尿病、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥等患者的紅細(xì)胞膜的膜脂流動(dòng)性明顯低于正常人［11］。

由于紅細(xì)胞持續(xù)暴露于充足的氧分壓環(huán)境中，富含與鐵結(jié)合的血紅蛋白，且膜中含有豐富的多不飽和脂肪酸，對(duì)氧化損傷較敏感，易導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的損傷和破壞，從而造成膜流動(dòng)性的降低、紅細(xì)胞剛性增加，影響微循環(huán)灌注。細(xì)胞膜過氧化反應(yīng)在體內(nèi)的進(jìn)程很難掌控，故本文用鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2-.）處理正常的和經(jīng)過藥物保護(hù)的紅細(xì)胞膜，觀察細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化。鄰苯三酚在堿性（pH 8.4左右）條件下自氧化產(chǎn)生O2-.，O2-.壽命極短，可通過連鎖反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基、單線態(tài)氧和過氧化氫，這些活性氧能直接或間接促使紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，并導(dǎo)致膜流動(dòng)性的降低［12］。

DPH是比較敏感的常用熒光探針，在水中熒光強(qiáng)度很低，當(dāng)嵌入到膜脂疏水區(qū)內(nèi)層時(shí)熒光強(qiáng)度可增加1 000倍。本實(shí)驗(yàn)用氧自由基攻擊紅細(xì)胞膜后，紅細(xì)胞膜脂熒光各向異性值和表觀微黏度值均明顯上升，表明紅細(xì)胞膜經(jīng)氧自由基攻擊后膜脂流動(dòng)性下降。預(yù)先將紅細(xì)胞膜與HSYA和SYB分別孵育，然后再用氧自由基進(jìn)行攻擊，紅細(xì)胞膜的熒光各向異性值和表觀微黏度值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且存在劑量與效應(yīng)關(guān)系，提示HSYA和SYB能阻止紅細(xì)胞膜脂流動(dòng)性的降低。本研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步闡明紅花改善微循環(huán)的作用機(jī)制，開發(fā)天然的心腦血管藥物具有重要意義。

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