焦媛媛,俞建中,潘克厚

(中國(guó)海洋大學(xué)應(yīng)用微藻生物學(xué)研究室,山東青島266003)

吲哚乙酸對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)和脂肪酸含量的影響

焦媛媛,俞建中,潘克厚＊＊

(中國(guó)海洋大學(xué)應(yīng)用微藻生物學(xué)研究室,山東青島266003)

研究不同濃度吲哚乙酸(Indole-3-Acetic Acid,IAA)對(duì)微擬球藻(N annochloropsis oculata)生長(zhǎng)和脂肪酸組成的影響。結(jié)果表明:在0.1 mg/L時(shí),低于0.5 mg/L時(shí)IAA促進(jìn)微擬球藻生長(zhǎng),但不影響葉綠素和不飽和脂肪酸合成; IAA促進(jìn)生長(zhǎng)作用最顯著,最大比生長(zhǎng)率為2.33 d-1。隨濃度進(jìn)一步增加,IAA促生長(zhǎng)作用越來(lái)越小,并抑制葉綠素和不飽和脂肪酸合成;在5 mg/L時(shí),IAA極顯著抑制EPA合成。添加適當(dāng)濃度IAA可促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng),縮短其生長(zhǎng)周期。

吲哚乙酸;微擬球藻;比生長(zhǎng)率;光密度法;葉綠素;脂肪酸

微擬球藻(N annochloropsis oculata)是1種重要的海洋經(jīng)濟(jì)微藻,屬真眼點(diǎn)藻綱。該藻藻體微小,含有豐富的二十碳五烯酸(Eicasapentaenoic acid,EPA, 20:5ω-3),但不含有二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid DHA,22:6ω-3)[1],已被作為優(yōu)良餌料大量應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[2]。另外,它還含有豐富的蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì),具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能,可作為人類食品添加劑和保健藥物[3]。

植物激素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。藻類和植物有很多相似之處,已經(jīng)有一些植物激素和生長(zhǎng)類似物在海洋藻類中被發(fā)現(xiàn)[4],也有關(guān)于植物激素對(duì)微藻生長(zhǎng)影響的報(bào)道[5-7]。已有研究證實(shí)IAA對(duì)某些微藻生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用[7-8],但I(xiàn)AA對(duì)細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)尤其是脂肪酸組成及含量的影響,研究較少,目前有報(bào)道IAA可以提高淡水微藻TH6 (Oedocladiumsp.)的總脂肪酸含量[9],對(duì)海洋微藻的影響未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)分析不同濃度IAA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞內(nèi)葉綠素、脂肪酸組成的影響,本研究擬找出IAA促微擬球藻生長(zhǎng)適合濃度,為大規(guī)模培養(yǎng)微擬球藻提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

微擬球藻(N.oculata),購(gòu)自澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織(CSIRO,Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation),編號(hào)為CS-179。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

用過(guò)濾煮沸的天然海水配制f/2培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件:溫度23℃;光照60～80μmol·m-2·s-1,光周期為12 h∶12 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取100 mg IAA(Sigma),溶于1 mL無(wú)水乙醇,加入雙蒸水,配成1 mg/mL儲(chǔ)存液。在350 mL培養(yǎng)基中接入起始接種密度20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL的藻細(xì)胞。設(shè)置5個(gè)IAA濃度0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L,不添加IAA為對(duì)照。三角瓶隨機(jī)放置,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 比生長(zhǎng)率測(cè)定 比生長(zhǎng)率是衡量生物量增長(zhǎng)快慢的參數(shù),適用于比較微藻細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法[10],在接種后第5天,微擬球藻進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,取適量藻液,加魯哥氏碘液進(jìn)行固定,在顯微鏡下計(jì)數(shù),每個(gè)處理取樣3次計(jì)數(shù)取其平均值,連續(xù)計(jì)數(shù)5 d,直至細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)末期,比較比生長(zhǎng)率的大小。比生長(zhǎng)率(μ)的計(jì)算公式如下: μ=(lnNt-lnNo)/t其中No表示初始藻密度,Nt表示t天后藻密度,t表示培養(yǎng)時(shí)間。

1.4.2 光密度測(cè)定 不同濃度的藻液與細(xì)胞密度呈線性關(guān)系[11],本實(shí)驗(yàn)利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,在400～660 nm,每隔10 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,繪制吸收曲線,確定最大吸收峰波長(zhǎng)[11],得出微擬球藻的最適波長(zhǎng)為440 nm,本實(shí)驗(yàn)初始接種密度較低,所以在接種后的第3天,用酶標(biāo)儀測(cè)定不同處理藻細(xì)胞培養(yǎng)液吸光值變化,連續(xù)測(cè)定10 d。

1.4.3 葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度測(cè)定 藻類活體細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度與其含量呈線性關(guān)系[12],流式細(xì)胞儀測(cè)定的FL4(675 nm)參數(shù)直接反應(yīng)單個(gè)細(xì)胞葉綠素的含量[13]。在接種后的第5天,微擬球藻進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,測(cè)定不同處理組葉綠素的含量。用f/2培養(yǎng)基稀釋5倍,保證細(xì)胞密度低于100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL,以對(duì)照組為陰性對(duì)照,測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化。

1.5 脂肪酸組成分析和含量測(cè)定

當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)末期,離心收集藻體,冷凍干燥。在Lepage和Toy的方法[14]上進(jìn)行改進(jìn),準(zhǔn)確稱取20 mg干燥藻粉放入螺口試管中,加入1 mL 2 mol/ L KOH-CH3OH溶液,于75℃水浴中皂化10 min,冷卻至室溫,加入1.5 mL 3 mol/L HCl-CH3OH溶液, 75℃水浴甲酯化10 min,冷卻至室溫,加入2 mL正己烷和少量的蒸餾水促進(jìn)分層,充分振蕩,離心取上層正己烷分析脂肪酸組成。

脂肪酸組成分析采用美國(guó)Agilent 6890 series GC system氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測(cè)器和HP-5毛細(xì)管柱(30 m×320μm×0.25μm,5%Phenyl Siloxane),根據(jù)待測(cè)峰與標(biāo)樣峰面積比和標(biāo)樣量計(jì)算各脂肪酸成分占總長(zhǎng)鏈脂肪酸的百分含量。進(jìn)樣后程序升溫:170℃恒溫1 min,然后以3℃/min的升溫速率升到210℃,保持25 min。進(jìn)樣口溫度為210℃。載氣為高純氮,流速45 mL/min,氫氣流速40 mL/min,空氣流速450 mL/min,分流比1∶20,進(jìn)樣量1μL。

2 結(jié)果

2.1 IAA對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)的影響

在添加不同IAA濃度(對(duì)照、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d,從第5天開始顯微計(jì)數(shù),計(jì)算比生長(zhǎng)率。由圖1可見(jiàn),當(dāng)IAA濃度低于0.1 mg/L,最大比生長(zhǎng)率均出現(xiàn)在計(jì)數(shù)的第7天,且0.05和0.1 mg/L IAA 2個(gè)處理組最大比生長(zhǎng)率都高于對(duì)照組,分別為0.58和0.62,說(shuō)明低濃度的IAA會(huì)刺激藻細(xì)胞加速生長(zhǎng)。IAA濃度升高,比生長(zhǎng)率低于對(duì)照組,出現(xiàn)了生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。5 mg/L IAA的比生長(zhǎng)率一直低于0,生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制。說(shuō)明高濃度的IAA會(huì)抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,處理組和對(duì)照組比生長(zhǎng)率差異減小,由于IAA濃度降低,并且微擬球藻進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)末期。通過(guò)其光密度的變化,如圖2所示,當(dāng)IAA的添加量為0.1 mg/L時(shí),光密度達(dá)到最大值,5 mg/L的IAA嚴(yán)重抑制了微擬球藻的生長(zhǎng),與比生長(zhǎng)率得到的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,其光密度差異變小,與比生長(zhǎng)率的逐漸變小相一致,微擬球藻細(xì)胞微小,顯微鏡計(jì)數(shù)造成的人為誤差較大,光密度的測(cè)定可以反映微擬球藻的細(xì)胞密度變化,可操作性強(qiáng),準(zhǔn)確性高。對(duì)其最終密度進(jìn)行單因素方差分析,由圖3可見(jiàn),當(dāng)IAA的添加量為0.1～5 mg/L與處理組差異顯著,當(dāng)IAA的濃度為0.1 mg/L時(shí),最終密度達(dá)到最大值為4 848萬(wàn)/mL,當(dāng)IAA的濃度為5 mg/L時(shí),嚴(yán)重抑制了微擬球藻的生長(zhǎng),最終密度為872萬(wàn)/mL。

圖1 微擬球藻在不同濃度IAA條件下的比生長(zhǎng)率Fig.1 Specific growth rate ofN annochloropsis oculata at different IAA concentrations

圖2 不同濃度IAA對(duì)微擬球藻光密度的影響Fig.2 Influence of IAA concentration on the optical density ofN annochloropsis oculata

圖3 微擬球藻在不同濃度IAA條件下的最終密度Fig.3 The final density ofN annochloropsis oculata at different IAA concentrations

通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定處于指數(shù)生長(zhǎng)期的微擬球藻單個(gè)細(xì)胞內(nèi)葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度,如圖4所示,通過(guò)單因素方差分析0.1和5 mg/L 2個(gè)處理組與對(duì)照組有差異, 0.1 mg/L IAA處理組微擬球藻細(xì)胞中葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯低于對(duì)照組,這種現(xiàn)象的解釋需要結(jié)合細(xì)胞密度分析,IAA使藻細(xì)胞處于分裂旺盛狀態(tài),數(shù)量明顯增加,但是葉綠素的合成速度低于細(xì)胞分裂速度,使單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的葉綠素含量減少。5 mg/L IAA嚴(yán)重抑制了藻細(xì)胞的生長(zhǎng),葉綠素的合成受到影響,單個(gè)細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯低于其余各組。

圖4 指數(shù)生長(zhǎng)期微擬球藻在不同濃度IAA條件下的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度Fig.4 The Chlorophyll fluorescence intensity of N annochloropsis oculataat the exponential growth phase at different IAA concentrations

2.2 不同濃度IAA對(duì)微擬球藻脂肪酸組成的影響

添加不同量的IAA對(duì)脂肪酸組成的影響見(jiàn)表1。與對(duì)照相比,當(dāng)IAA的濃度在0.1 mg/L時(shí),14∶0、16∶0、16∶1在總脂肪酸中的比例有所提高,而20∶4、20∶5的比例有所降低,采用Duncan多重比較法,其差異顯著。添加此濃度生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂活動(dòng)活躍,藻細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)飽和脂肪酸的合成,抑制了不飽和脂肪酸尤其是EPA的合成。當(dāng)濃度為0.05和0.5 mg/L時(shí),對(duì)脂肪酸進(jìn)行多重比較,結(jié)果顯示與對(duì)照組之間、相互之間不存在顯著差異,這說(shuō)明對(duì)生長(zhǎng)影響不顯著的IAA濃度同樣對(duì)脂肪酸合成無(wú)明顯作用。隨著IAA濃度的升高,使微擬球藻的生長(zhǎng)和葉綠素含量受到嚴(yán)重影響,光合作用下降,影響了細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)的合成,使不飽和脂肪酸的合成大大受到影響。當(dāng)濃度為1和5 mg/L時(shí),EPA在總脂肪酸總的比例下降,與對(duì)照組差異顯著。

表1 不同濃度的IAA對(duì)微擬球藻脂肪酸組成的影響Table 1 Influence of IAA concentration on the fatty acid composition ofN annochloropsis oculata

3 討論

生長(zhǎng)素是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的植物激素[15],已有研究證明生長(zhǎng)素大部分是由吲哚類化合物組成,其中吲哚乙酸IAA是含量最高的1種生長(zhǎng)素,不僅能夠在高等植物體內(nèi)合成,也可以在藻類細(xì)胞中合成[16],已發(fā)現(xiàn)藻類存在T1R1生長(zhǎng)素受體[17],當(dāng)IAA作用于細(xì)胞時(shí),首先與受體結(jié)合,促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的生物合成,為細(xì)胞分裂提供物質(zhì)基礎(chǔ),促進(jìn)性狀的產(chǎn)生[15]。在高等植物中,植物激素參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生理過(guò)程.如強(qiáng)化植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[18]。在海洋藻類中,已有研究證明IAA可以促進(jìn)大型海藻孔石莼的生長(zhǎng)和分裂[19],本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比生長(zhǎng)率、最終藻細(xì)胞濃度和光密度比較發(fā)現(xiàn),當(dāng)IAA的添加量為0.1 mg/L時(shí),明顯促進(jìn)微擬球藻生長(zhǎng),但高濃度IAA卻抑制微擬球藻生長(zhǎng),這個(gè)現(xiàn)象也同樣存在于高等植物中[20],IAA對(duì)微擬球藻葉綠素的合成無(wú)明顯促進(jìn)作用,過(guò)高濃度的IAA抑制了藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素的合成,所以,選擇適當(dāng)?shù)腎AA濃度才能促進(jìn)微擬球藻的生長(zhǎng)。

關(guān)于微擬球藻長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的生物合成途徑已有一些報(bào)道,從18∶2開始以n-3和n-6 2條途徑合成多不飽和脂肪酸[21]。已有報(bào)道生長(zhǎng)抑制劑可以提高微擬球藻中EPA的含量[21],本實(shí)驗(yàn)得出IAA對(duì)不飽和脂肪酸的合成無(wú)明顯促進(jìn)作用。高濃度IAA嚴(yán)重抑制了EPA的合成,目前沒(méi)有關(guān)于植物激素對(duì)脂肪酸合成途徑中所起具體作用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。文中設(shè)想高濃度IAA抑制微擬球藻的生長(zhǎng),葉綠素含量降低影響光合作用效率,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的生物合成受到限制,使不飽和脂肪酸的底物或合成過(guò)程中酶的含量降低,從而抑制了不飽和脂肪酸的合成。但需要更深入研究才能闡明真實(shí)機(jī)理。

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Abatract: The effects of IAA(indole-3-acetic acid,IAA)on the growth and fatty acid composition of N annochloropsis oculatawere investigated.When the concentration was lower than 0.5 mg/L,IAA promoted the growth ofN.oculataand did not affect the synthesis of chlorophyll and unsaturated fatty acids.The most significant promotion to the growth was observed when IAA was 0.1 mg/L.The fastest cell specific growth rate was 2.33 d-1.When the concentration was higher than 0.1 mg/L,IAA gradually attenuated its promotion to the growth ofN.oculataand performed its inhibition of the biosynthesis of chlorophyll and unsaturated fatty acids with the increase of concentration.When the concentration was 0.5 mg/L,IAA most significantly inhibited the synthesis of eicosapentaenoic acid(EPA),making the percentage of EPA the lowest among the analyzed.Addition of IAA at an appropriate concentration promotes the growth of microalgal cells and shortens their growth cycle.

Key words: Indole-3-acetic acid(IAA);N annochloropsis oculata;specific growth rate;optical density; chlorophyll;fatty acid

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Effects of Indole-3-acetic Acid on the Growth and Fatty Acid Composition of Nannochloropsis oculata

J IAO Yuan-Yuan,YU Jian-Zhong,PAN Ke-Hou
(Lab of Applied Microalgae Biology,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Q948.8;Q949.9

A

1672-5174(2011)04-057-04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD09A12)資助

2009-10-13;

2009-11-09

焦媛媛(1985-),女,碩士,主要從事微藻生態(tài)研究。E-mail:lemon198566@yahoo.com.cn

E-mail:khpan@ouc.edu.cn