楊芳莉，刁騁，韋星呈，曾艷，嚴(yán)丹丹

(沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034)

白細(xì)胞介素10(interleutin－10，IL－10) 是由 T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子［1－2］。也有研究指出調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 (Treg)才是體內(nèi)IL－10的主要來源［3］。人類和小鼠的 IL－10 受體 (interleutin－10 receptor，IL－10R) 由 IL－10R1 和 IL－10R2 兩個亞單位組成。IL－10R2 不與 IL－10 發(fā)生結(jié)合，IL－10R1是IL－10R中與IL－10結(jié)合的亞單位，人類T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)較高水平IL－10R1［4］，活化后的T細(xì)胞IL－10R1表達(dá)水平有所下調(diào)［5］。與人類不同的是，小鼠靜息 T淋巴細(xì)胞表面不表達(dá) IL－10R1［6］。國外有報道指出小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞接受抗原刺激后IL－10R1在細(xì)胞表面可有短暫的表達(dá)［7］，但關(guān)于CD4+T淋巴細(xì)胞相關(guān)方面的報道較少。本實驗對抗原刺激后小鼠 CD4+T淋巴細(xì)胞表面 IL－10R1表達(dá)情況進(jìn)行檢測，為進(jìn)一步研究IL－10相關(guān)免疫疾病的發(fā)病及進(jìn)展提供有力支持。

1材料與方法

1.1 材料 試劑：小鼠 anti－CD4－FITC標(biāo)記熒光抗和 anti－IL－10R1－PE 標(biāo)記熒光抗體均購自 Biolegend公司;anti－CD28 和 anti－CD3 抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司公司;RPMI－1640培養(yǎng)基和小牛血清購自GIBCO GRL公司;尼龍毛購自日本和光純藥工業(yè)株式會社 (WOKA)。實驗動物：SPF級6～8周齡 C57BL/6小鼠 (雌性)10只購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備 處死小鼠，無菌條件下分離脾臟，注射器沖洗脾臟，無菌冷紅細(xì)胞裂解液處理后，洗滌細(xì)胞。加入適量PBS，充分混勻細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107cell/ml。

1.2.2 尼龍毛去除B細(xì)胞 稱取尼龍毛100 mg，充分填塞于5 ml注射器針筒內(nèi)，用適量PBS平衡。將脾細(xì)胞懸液緩慢經(jīng)過尼龍毛，過濾兩次，將所得細(xì)胞重新調(diào)整濃度至1×106cell/ml。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)無菌分選CD4+T淋巴細(xì)胞加入 anti－CD4－FITC 標(biāo)記抗體 1 μg/L × 106cells，室溫避光孵育30 min，500 r/min，離心5 min，清洗兩次后，500 μl PBS重懸細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀無菌分選，收集得到的CD4+T細(xì)胞，用加有10%小牛血清的RPMI－1640調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106cell/ml。將細(xì)胞放置于24孔培養(yǎng)板中無菌培養(yǎng)，1×105cell/孔。

1.2.4 抗原刺激 向各孔中分別加入 anti－CD3(1：200)和anti－CD28(1：200)多克隆抗體對細(xì)胞進(jìn)行刺激，并且無菌培養(yǎng)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測IL－10R1表達(dá)情況 抗原刺激后0 h，12 h，24 h，48 h，72 h分別收集細(xì)胞，無菌PBS清洗，1 500 r/min，離心5 min。將細(xì)胞重懸于100 μl PBS中，輕彈起細(xì)胞，加入anti－IL－10R1－PE 抗體 0.2 μg/L × 106cells，室溫避光孵育30 min，500 r/min，離心5 min，清洗兩次后，500 μl PBS重懸細(xì)胞。以未加任何抗體的細(xì)胞做空白對照。流式細(xì)胞分析術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞表面IL－10R1表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)無菌分選CD4+T淋巴細(xì)胞結(jié)果(圖1) 從圖1可見大量CD4+T淋巴細(xì)胞被選出，符合進(jìn)一步實驗要求。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分選CD4+T淋巴細(xì)胞結(jié)果圖(方框中為分選出的CD4+T淋巴細(xì)胞)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測刺激各個時段CD4+T淋巴細(xì)胞IL－10R1表達(dá)情況 (圖2) 從圖2可見，0 h時CD4+T淋巴細(xì)胞幾乎不表達(dá)IL－10R1，12 h時IL－10R1表達(dá)上升，24 h時達(dá)到高峰，48 h時IL－10R1表達(dá)開始下降，72 h時表達(dá)水平與0 h接近。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測刺激各個時段CD4+T淋巴細(xì)胞IL－10R1表達(dá)水平結(jié)果圖

3 討論

本研究中，小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞未接受抗原刺激時不表達(dá)IL－10R1，因此不能與IL－10結(jié)合并接受IL－10對細(xì)胞的調(diào)控。但是這種來源于IL－10的免疫調(diào)控作用在小鼠體內(nèi)對T淋巴細(xì)胞并非無效，在抗原刺激后，小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞開始逐漸表達(dá)IL－10R1，在24 h時達(dá)到頂峰，隨后受體的表達(dá)水平開始下降，在72 h后恢復(fù)到未接受抗原刺激時 (0 h的水平)?？梢娫谛∈篌w內(nèi)，IL－10作為一種重要的免疫抑制性調(diào)節(jié)因子，并不是始終直接對CD4+T淋巴細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，這種直接的調(diào)節(jié)作用很可能體現(xiàn)在CD4+T淋巴細(xì)胞接受抗原刺激表達(dá)IL－10R1的短暫時間段內(nèi);在這個時間段內(nèi)，IL－10也很有可能參與了CD4+T淋巴細(xì)胞的分化過程。與小鼠不同的是，人類CD4+T淋巴細(xì)胞在未接受抗原刺激時就表達(dá)高水平的 IL－10R1［4］，在接受抗原刺激后 IL－10R1 的表達(dá)水平有所下降。也有研究指出活化后的單核巨噬細(xì)胞IL－10R1 表達(dá)水平上調(diào)［5］，這提示在人類 IL－10 直接對T淋巴細(xì)胞的抑制作用隨著活化是逐漸減弱，通過對抗原提呈細(xì)胞的抑制來間接對活化的T淋巴細(xì)胞起到很好的調(diào)控作用?？傊琁L－10在小鼠體內(nèi)和人類體內(nèi)都對活化后的CD4+T淋巴細(xì)胞起到直接的調(diào)節(jié)作用，因此可以在模型小鼠身上研究在IL－10R1表達(dá)這一時間段內(nèi) IL－10對 CD4+T淋巴細(xì)胞直接作用，為進(jìn)一步探討在人體中IL－10對CD4+T淋巴細(xì)胞的作用提供強(qiáng)有力的幫助，從而對進(jìn)一步揭示相關(guān)的自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展情況，尋找治療新靶點(diǎn)具有重要意義。

目前，IL－10基因作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)遺傳候選基因，成為研究SLE發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)，同時也因其免疫抑制功能而成為研究其他自身免疫病發(fā)病機(jī)制的重要靶點(diǎn)。有人發(fā)現(xiàn)小鼠IL－10對小鼠B淋巴細(xì)胞的作用，在小鼠IL－10R1分子胞漿區(qū)呈區(qū)段分布，且靠近細(xì)胞膜的一段區(qū)域與抑制性調(diào)節(jié)有關(guān)［8］。還有人指出NZW狼瘡小鼠的IL－10R1基因在此區(qū)段具有突變，并且導(dǎo)致編碼氨基酸發(fā)生改變，這有可能使IL－10的免疫抑制功能受到影響，成為狼瘡發(fā)病的原因［6］。IL－10作為體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，進(jìn)一步研究自身免疫病小鼠模型中IL－10通過IL－10R1對T淋巴細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，對揭示自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制和指導(dǎo)臨床治療有重要意義。

［1］Ho AS，Moore KW.Interleukin－10 and its receptor ［J］.Ther Immunol，1994，1：173 －185.

［2］Moore KW，O’Garra A，de Waal Malefyt R，et al.Interleukin－10 ［J］.Annu Rev Immunol，1993，11：165 －190.

［3］Jankovic D，Kullberg MC，F(xiàn)eng CG，et al.Conventional T－bet－Foxp3－Th1 cells are the major source of host－protective regulatory IL10 during intracellular protozoan infection ［J］.J Exp Med，2007，204：273－283.

［4］Valencia－Pacheco G，Layseca－Espinosa E.Expression and function of IL－10R in mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus ［J］.Scand J Rheumatol，2006，35(5)：368－378.

［5］Liu Y，Wei SH－Y，Ho AS－Y，et al.Expression cloning and characterization of a human interleukin－10 receptor ［J］.J Immunol，1994，152：1821 －1829.

［6］Qi ZM，Wang J，Sun ZR，et.al.Polymorphism of the mouse gene for the interleukin 10 receptor alpha chain(Il10ra)and its association with the autoimmune phenotype ［J］.Immunogenetics，2005，57：697－702.

［7］Partha SB，Virginia P，Alexander P，et al.Pathogen－specific CD8 T cell responses are directly inhibited by IL－10 ［J］.J Immunol，2007，179(7)：4520 －4528.

［8］Ho AS，Wei SH，Mui AL，et al.Functional regions of the mouse interleukin－10 receptor cytoplasmic domain ［J］.Mol Cell Biol，1995，15(9)：5043 －5053.