張 姝，莫 非，孫朝琴，張 然，王 瑩，李 寅，羅昭遜，夏曙華

幽門螺桿菌是淺表性胃炎、消化性潰瘍的致病因子，與胃癌、胃粘膜相關性淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關［1］。目前治療和控制Hp感染的主要手段是抗生素治療，在治療Hp感染的抗生素中以甲硝唑應用最廣，隨著甲硝唑的廣泛應用，其耐藥性問題日益突出，已成為治療失敗的主要原因之一［2］。Hp對甲硝唑耐藥機制尚未完全明了，目前主要認為對氧不敏感的NADPH硝基還原酶（Rdx A）失活是導致甲硝唑耐藥的關鍵，該酶的編碼基因為rdx A基因［3］。有文獻報道參與Hp對甲硝唑耐藥的硝基還原酶還包括：3種鐵氧還蛋白類似物（Fdx B）、NADPH 黃素氧還酶（Frx A）等［4－5］。但在 Hp耐甲硝唑機制的研究中，對fdx B和frx A的報道甚少，本文擬采用PCR擴增rdx A、fdxB和frx A基因，并對這3個基因測序分析，探討Hp對甲硝唑耐藥與rdx A、frx A和fdx B點突變的關系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 采自貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院，60例患者因胃部不適行胃鏡檢查，標本取自其胃竇部或胃體部粘膜，并且C14尿素呼氣試驗為陽性的情況下，進行Hp的分離培養(yǎng)所得。國際標準測序株Hp26695株購自ATCC。

1.2 主要試劑 E－Test試驗條、微需氧袋：法國梅里埃公司；哥倫比亞血瓊脂粉：OXOID；DNA提取試劑盒：北京天恩澤基因科技有限公司。

1.3 Hp的分離培養(yǎng)及鑒定 取胃竇部內鏡活檢組織，接種于幽門螺桿菌選擇培養(yǎng)基平板，微需氧37℃培養(yǎng)3～7 d，進行Hp鑒定及培養(yǎng)。

1.4 藥敏試驗 采用E－Test法檢測Hp對甲硝唑的最低抑菌濃度（MIC）。用 Hp標準測序株Hp26695作每批試驗的質控標準。以MIC值≥8 μg/m L判定為甲硝唑耐藥，MIC值≥32μg/m L判定為高水平甲硝唑耐藥［6］。

1.5 Hp基因組DNA提取 提取DNA按照試劑盒說明書操作。用紫外分光光度計對提取的DNA純度進行測定，計算 OD260nm/OD280nm比值。模板DNA于1.0%瓊脂糖凝膠孔中電泳。

1.6 PCR 擴增 根據(jù)文獻［7］設計rdx A、fdx B和frx A基因的特異性引物，見表1。引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應體系為反應體系為50μL，其中包括：dd H2O 19μL，上游引2μL，下游引物2μL，模板DNA 2μL，Primix Teq 25μL。循環(huán)條件：預變形94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火53.7℃（其中fdx B退火59℃～60℃，frx A退火59℃～60℃）；延伸72℃2 min；最終延伸72℃，10 min。每次擴增時均設置陽性對照、陰性對照及空白對照。最后瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 rdx A、fdxB、frx A引物序列Tab.1 Primers of rdxA，fdxB and frx A

1.7 PCR產(chǎn)物測序及序列分析 PCR產(chǎn)物送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。測序結果經(jīng)美國國立生物技術信息中心（NCBI）中的BLAST軟件分析。

2 結 果

2.1 Hp的培養(yǎng)及藥敏結果 60例病人胃粘膜標本分離出11株Hp，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢呈陰性，菌體細長彎曲呈螺形，S型或海鷗型。過氧化氫酶實驗、氧化酶實驗及尿素酶實驗，均為陽性。采用ETest法測定11株臨床株對甲硝唑的MIC均≥256 μg/m L，為高水平耐藥株。

2.2 PCR擴增結果 11株臨床株和國際標準測序株Hp26695的DNA純度經(jīng)紫外分光光度計測定，260 nm/280 nm比值均在1.8～2.0之間。PCR擴增出11株臨床株和1株標準株rdx A、frx A和fdxB基因，分別在750 bp、870 bp、830 bp位置出現(xiàn)特異條帶，見圖1。

圖1 模板DNA及PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖注：A圖為模板DNA；B圖為rdx A；C圖為fdxB；D圖為frx A；M：DNA marker；陰：陰性對照；陽：標準株Hp26695；其余為臨床株。Fig.1 Agarose gel electrophoresis maps of DNA templates and PCR amplification productsNote：Picture A for DNA templates；B for rdx A；C for fdxB；D for frx A；M for marker，positive for the standard strain Hp26695，the rest for clinical strains

2.3 產(chǎn)物測序結果 11株臨床株與NCBI已登錄的國際標準測序株Hp26695相應基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)rdx A、fdx B、frx A基因存在堿基替換、插入和缺失3種類型的突變，這些基因突變呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，即在某些位點存在共同突變（共同突變位點見表1），除此，還存在隨機位點的散在突變。耐藥菌與敏感菌核苷酸同源性：rdx A和fdxB為95%～98%，frx A低于94%。

3 討 論

硝基咪唑類藥物甲硝唑（MTZ）是一種具有抑菌活性的藥物前體，經(jīng)Hp的細胞膜被動擴散進入胞漿，在胞漿中的硝基還原酶的作用下，能獲得低于－430 m V氧化還原電位，使甲硝唑的硝基還原成羥胺衍生物，還原產(chǎn)物與DNA作用引起鏈斷裂，導致細菌死亡，這是甲硝唑的抗Hp機制［3，8］。因其殺菌活性不受胃內低p H的影響，在胃腔內濃度高，具有較強的抗Hp活性，因此常用于Hp感染的一線治療［9］，是三聯(lián)方案中最廣泛應用的抗菌素之一。隨著抗生素的廣泛使用，Hp對甲硝唑的耐藥率呈逐年上升趨勢。本實驗從60例病人胃粘膜標本分離出11株Hp菌株，采用E－Test法測定11株臨床株對甲硝唑的MIC均≥256μg/m L，均為高水平耐藥株。

表2 11株耐藥菌rdx A、fdxB和frxA基因的相同突變位點和突變形式Tab.2 The same mutations sites and forms of rdxA，fdxB and frx A in 11 resistant strains

Kwon等研究表明Hp對甲硝唑耐藥與編碼參與甲硝唑氧化還原反應的酶的基因（rdx A、frx A、fdx B）突變有關［10］。這些基因的堿基插入、缺失、轉化等導致下游氨基酸序列全部或部分發(fā)生改變，導致其翻譯的蛋白質改變，引起硝基還原酶活性降低或失活，不能還原甲硝唑而引起耐藥。但對氧不敏感的NADPH硝基還原酶（Rdx A）最為關鍵，國外有研究表明，耐甲硝唑的Hp中的Rdx A蛋白缺失或生成減少［11－12］。本研究對11株耐藥菌和1株敏感菌進行rdx A擴增并測序，發(fā)現(xiàn)11株耐藥菌均存在插入、缺失和堿基轉換3種突變類型，以堿基轉換為突變的主要類型，未發(fā)現(xiàn)大片段序列插入或缺失，只出現(xiàn)單個堿基插入或缺失，即均表現(xiàn)為點突變。已有報道認為耐甲硝唑Hp菌株的rdx A基因突變大多為隨機性的，未能肯定某一位點突變與耐藥直接相關［13］。本試驗也發(fā)現(xiàn)rdx A基因變異位點大多不固定，但11株耐藥菌存在4個固定的突變位點，即均發(fā)生了1013598nt A→G，1013619nt G→A，1013961nt C→T，1014149nt A→G，這些位點的改變均未見文獻報道，我們推測這些位點的突變與甲硝唑的耐藥可能有密切的關系。

Hp的frx A基因和fdx B基因的變異在Hp對甲硝唑中－高度耐藥中發(fā)揮重要作用［4］。有研究證實單一fdx B基因突變導致Hp對甲硝唑的低水平的耐藥甚至不耐藥，rdx A或frx A基因突變會產(chǎn)生中等程度的耐藥，但當rdx A與fdx B或frx A聯(lián)合突變則會產(chǎn)生高水平耐藥［10，14］。本文對11株高水平耐藥菌的frx A基因和fdx B基因進行擴增和測序分析，發(fā)現(xiàn)耐藥株和標準株均攜帶有frx A和fdx B基因，且發(fā)生不同程度的變異，多表現(xiàn)為隨機位點的插入、缺失、轉化及顛換，未發(fā)現(xiàn)大片基因的插入，但是同時也呈現(xiàn)出一些規(guī)律性的變化，如：frx A基因測序結果在以下3個位點出現(xiàn)了共同突變：688585nt T插入，688470nt C→T，688041nt T→C，同源性為95%～98%；fdx B的基因測序結果表明，11株高水平的耐藥株均發(fā)生變異，有以下共同突變位點，即 1581618nt處 G→A，1581795ntC→T，1581996nt T→C，1582038nt T→C，同源性低于94%。我們推測這些高頻的突變位點可能在該基因所編碼的蛋白產(chǎn)物失活中起重要作用。從本研究的實驗結果來看，11株高水平耐甲硝唑的Hp菌同時發(fā)生了rdx A、frx A和fdx B基因突變，這在一定程度上證實了frx A和fdx B基因突變在rdx A基因突變所誘導的甲硝唑耐藥中起協(xié)同作用。frx A基因和fdx B在甲硝唑耐藥中是否單獨起作用還需要增加甲硝唑敏感株，需要更多的實驗數(shù)據(jù)去做進一步的研究。

研究Hp對甲硝唑的耐藥機制可揭示藥物作用細菌后信號轉導機制，為個體化用藥以及選擇合適的抗生素用于臨床治療奠定基礎。本文從基因組角度探討Hp對甲硝唑耐藥的分子機制，提示了Hp對甲硝唑耐藥性不僅可能與rdx A點突變有關，同時亦可能與frx A和fdxB基因突變相關。為進一步研究和分析Hp耐藥機制提供了有價值的資料。

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