魏淑貞，趙秀芹，劉志廣，萬康林

2.福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）引起的慢性消耗性傳染病。目前，結(jié)核病疫情日益惡化，耐藥及耐多藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重。其中鏈霉素（streptomycin，SM）耐藥比例居高不下。第4次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查獲悉我國結(jié)核分枝桿菌SM耐藥率為17.3%，僅次于異煙肼（isoniazid，INH）耐藥［1］，引起有關(guān)人士的高度關(guān)注。SM是最早用于治療結(jié)核病的一線藥物，由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，運(yùn)用傳統(tǒng)的方法從分離，鑒定到獲得藥物敏感性結(jié)果往往需要6～8 w。因此，結(jié)核分枝桿菌SM耐藥的快速診斷方法尤為重要，日益受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。為了解我國結(jié)核分枝桿菌SM耐藥的情況和耐藥基因突變的特點(diǎn)，以及為進(jìn)一步快速檢測SM耐藥方法的建立提供依據(jù)，我們對從福建省、河南省、湖南省、安徽省和四川省及西藏自治區(qū)收集的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了SM耐藥的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 302株菌株由福建?。?6株）、河南?。?7株）、湖南?。?8株）、安徽?。?0株）和四川省（31株）及西藏自治區(qū)（110株）的結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)提供，結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv購買于中國生物制品藥品檢定所。

1.2 菌株分離鑒定和藥物敏感性試驗(yàn) 菌株用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，用含對硝基苯甲酸（PNB）和噻吩－2－羧酸肼（TCH）的培養(yǎng)基鑒別結(jié)核分枝桿菌，牛結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。根據(jù)WHO推薦的比例法［1］進(jìn)行藥物敏感性測定，含藥培養(yǎng)基的藥物臨界濃度分別是：INH 0.2μg/m L，RFP 40 μg/m L，SM4μg/m L，EMB 2μg/m L和PAS 0.5 μg/m L。

1.3 提取DNA 亂取常規(guī)L－J培養(yǎng)基上生長良好的結(jié)核菌落，一菌環(huán)溶于400μLTE（p H8.0）中，在旋渦振蕩器上震蕩至塊狀固體菌落均勻溶于TE中，沸水浴15 min，快速離心，取上清備用。

1.4 擴(kuò)增rpsL基因及測序檢測rpsL基因（GeneID888259）是結(jié)核分枝桿菌染色體上的結(jié)構(gòu)基因，全長375 bp，其編碼核糖體蛋白S12。用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長為608 bp。上游引物為5′GGC GGC TTA CGC TTG ATG3′；下游引物為5′TCC GTA GAC CGG GTC GTTG3′。引物由賽百盛公司合成。PCR緩沖液，MgCl2，d NTP，Taq酶從上海生物工程公司購買。采用50μLPCR反應(yīng)體系，其中包括模板DNA 9μL、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L d NTP、上下游引物各15 pmol和1.5 U Taq DNA酶。PCR的反應(yīng)條件是：94℃5 min，94℃45 s，55℃30 s，72℃45 s，72℃5 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增整個(gè)rpsL基因。PCR產(chǎn)物先用1.5%瓊脂糖凝膠電泳判斷目的片段的位置（如圖1），確認(rèn)是單一的目的條帶后直接送到上海生工公司進(jìn)行純化測序。

1.5 測序結(jié)果比對 測序序列以純文本形式查詢序列輸入到 www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST的查詢框中，與H37RV的序列進(jìn)行比對。同時(shí)排除測序引起的誤差判斷測序結(jié)果。

1.6 分析數(shù)據(jù) 菌株背景及測序結(jié)果用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析相關(guān)數(shù)據(jù)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 302株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，SM 敏感株120株，占39.74%（120/302），其中59株對抗結(jié)核藥物——INH、RFP、SM、EMB，PAS全部敏感，對SM敏感的耐藥株有61株（其中耐多藥46株）；對SM耐藥的菌株有182株（其中耐多藥150株），耐藥率為60.26%（182/302），其中單耐SM 的菌株有6株，占3.30%（6/182），以含耐SM兩種及以上藥物耐藥的菌株為主，占96.70% （176/182）?？?耐 多 藥 率 為 64.90%（196/302）。具體的藥物敏感性結(jié)果見表1。

表1 302株結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of drug susceptibility test（DST）for 302 MTB isolates

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖片 用Premier5.0自行設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增整個(gè)結(jié)核分枝桿菌rpsL基因，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長為608 bp。如圖1所示為擴(kuò)增產(chǎn)物，含整個(gè)rpsL基因片段。

圖1 結(jié)核分枝桿菌rpsL基因PCR結(jié)果M：100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；0：陰性對照；H：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株；1～4：結(jié)核分枝桿菌臨床分離株Fig.1 PCR results of rpsL in MTB M：DNA marker；0：Negative；H：H37Rv；1－4：MTB isolates

2.3 測序結(jié)果 302株結(jié)核分枝桿菌rps L基因測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，168株沒有檢測到突變；134株存在突變。96株結(jié)核分枝桿菌rpsL基因第43位密碼子發(fā)生AAG→AGG（Lys43 Arg，賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔┩蛔?，其中95株為SM耐藥，SM耐藥株發(fā)生突變的頻率為52.20%（95/182）。37株菌株第88位密碼子發(fā)生突變，其中5株SM敏感株發(fā)生AAG→AGG（Lys88 Arg，賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔┑耐蛔儯?2株SM耐藥株第88位密碼子發(fā)生突變，涉及4種突變類型，其中28株發(fā)生AAG→AGG（Lys88 Arg，賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔┩蛔?，Lys88Arg突變率為15.38%（28/182），有2株 AAG→ATG（Lys88Met，賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍彼幔┩蛔?，突變率?.10%（2/182），AAG→CAG（Lys88Gln，賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０罚┖虯AG→ACG（Lys88Thr，賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸）各有1株，突變率均為0.55%（1/182）。另外有1株SM耐藥菌株第86位密碼子發(fā)生CGG→CAG（Arg86Gln，精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０罚┩蛔儯蛔兟蕿?.55%。

2.4 藥物敏感性結(jié)果與rpsL基因突變的關(guān)系59株結(jié)核分枝桿菌全敏感株rpsL基因沒有發(fā)生突變。61株對SM敏感的耐藥株中有6株菌株的rpsL基因發(fā)生突變。因此，SM敏感株rpsL基因突變率是5.00%（6/120）。182株SM 耐藥株檢測到基因突變的菌株有128株，SM耐藥株的突變率是70.33%。SM敏感株和SM耐藥株突變率的比較見表2。

表2 SM敏感株和耐藥株基因突變率的比較Tab.2 Comparison of gene mutation rates in SM sensitive and SM resistant strains

2.5 耐多藥菌株rpsL基因突變特點(diǎn) 196株耐多藥菌株中有46株對SM敏感，150株對SM耐藥。耐多藥菌株中有110株rps L基因發(fā)生突變。對SM耐藥且發(fā)生基因突變的106株耐多藥菌株當(dāng)中，有78株43位密碼子AAG→AGG突變，占73.58%；有27株88位密碼子發(fā)生突變，共4種突變類型，依次為23株AAG→AGG突變，占21.70%，2株 AAG→ATG 突變，占1.89%，AAG→CAG突變和AAG→ACG突變各1株，均占0.94%；另有1株86位密碼子CGG→CAG（Arg→Gln）突變，占0.94%。詳見表3、4。

表3 耐多藥含SM敏感或耐藥的菌株與rpsL基因變異的關(guān)系Tab.3 Relationship between rpsL mutation in MDR strains and SM susceptibility

表4 耐多藥菌株基因突變位點(diǎn)與SM耐藥的關(guān)系Tab.4 Relationship between mutation sites in MDR and SM resistance

3 討 論

SM是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)與核糖體相互作用的抗生素。1944年，Selman Waksman發(fā)現(xiàn)SM可用于治療結(jié)核病，并與INH（H）、RFP（R）、EMB（E）成為治療結(jié)核病的一線藥物［2］。早在1946年，就已經(jīng)有關(guān)于結(jié)核分枝桿菌對SM 產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道［3］。SM是在核蛋白體水平上干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的。它主要的作用部位是核蛋白體的30S亞基，該亞基是由21種核蛋白體和1種16Sr RNA組成的。SM與核蛋白體30S亞基結(jié)合，抑制A位點(diǎn)功能，引起遺傳密碼的錯(cuò)讀SM、翻譯啟動(dòng)的抑制及異常校正，最終抑制蛋白質(zhì)合成從而表現(xiàn)為抗菌活性［4－5］。核糖體蛋白S12的正常作用可能是維持讀碼過程中的一些輕微的不準(zhǔn)確性，而突變的S12核蛋白卻嚴(yán)格要求核糖體只使用與每一個(gè)密碼子對應(yīng)的氨酰－t RNA，從而抑制了SM誘導(dǎo)的遺傳密碼錯(cuò)讀而產(chǎn)生耐藥性［6］。

本研究對經(jīng)藥物敏感性試驗(yàn)確認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌的302株臨床分離株進(jìn)行rpsL基因的擴(kuò)增測序，分析檢測到的突變。SM敏感株120株，59株全敏感結(jié)核分枝桿菌臨床分離株經(jīng)測序沒有發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變。61株SM敏感的耐藥株中有6株發(fā)生點(diǎn)突變，其中1株43位密碼子發(fā)生AAG→AGG（Lys→Arg）突變，5株88位密碼子發(fā)生AAG→AGG（Lys→Arg）突變，故SM 敏感株的突變率是5.00%（6/120）。

182株SM耐藥株包括6株SM單耐藥和174株含耐SM的多耐藥株，其中主要是以耐多藥（HRS，HRES，HRSP，HRESP）為主，占81.87%（149/182），耐多藥率是49.34%（149/302），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第4次全國結(jié)核病調(diào)查顯示的我國耐多藥率（10.7%）［1］。這可能和標(biāo)本的來源和標(biāo)本的選擇有關(guān)，本研究的標(biāo)本均來自結(jié)核病防治醫(yī)院，一般在醫(yī)院治療的病人多為結(jié)核病重癥病例。SM耐藥菌株發(fā)生的點(diǎn)突變主要以43位密碼子和88位密碼子均發(fā)生AAG→AGG（Lys→Arg）為主，43位密碼子突變比88位密碼子突變常見，這和國內(nèi)外相關(guān)的報(bào)道一致［7］。研究發(fā)現(xiàn)88位密碼子的改變涉及4種突變類型，除了常見的AAG→AGG（Lys→Arg）外，還發(fā)生AAG→ATG（Lys→Met），AAG→CAG（Lys→Gln）和AAG→ACG（Lys→Thr）突變，該位點(diǎn)的這些罕見突變［8］也曾經(jīng)被報(bào)道過。由此可見，88位密碼子的突變類型具有多樣性。而在耐多藥菌株中，SM敏感菌株與SM耐藥株的88位密碼子突變率之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3.47，P＝0.062）。本研究還發(fā)現(xiàn)1株86位密碼子發(fā)生CGG→CAG（Arg→Gln）突變，目前沒有見到國內(nèi)外有相關(guān)報(bào)道，該突變位點(diǎn)與耐藥的關(guān)系需要進(jìn)一步驗(yàn)證。這些罕見的突變均發(fā)生于耐SM的耐多藥菌株當(dāng)中。

測序檢測到SM耐藥株有128株發(fā)生突變，突變率是70.33%（128/182），SM 敏感株的突變率是5.00%（6/120），兩者之間的差異經(jīng)卡方分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝125.05，P＜0.05）。耐多藥含SM耐藥的菌株rpsL基因突變率明顯高于耐多藥但SM敏感的菌株rps L基因突變率，經(jīng)分析，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的（χ2＝54.90，P＜0.05）。耐多藥含SM耐藥的菌株rpsL基因43位密碼子突變率明顯高于耐多藥，但SM敏感的菌株rpsL基因43位密碼子突變率，經(jīng)分析，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝36.32，P＜0.05）。進(jìn)一步證實(shí)了rpsL基因突變與結(jié)核分枝桿菌SM耐藥高度相關(guān)，其中43位密碼子AAG→AGG（Lys→Arg）突變是主要突變類型，PCR－DS檢測rps L基因突變可以用于臨床結(jié)核菌SM耐藥的快速檢測。本研究還有一部分SM耐藥株沒有檢測到突變，提示SM耐藥可能存在其他的耐藥機(jī)制，有待于進(jìn)一步的研究。正如Finken等曾報(bào)道了約25%結(jié)核分枝桿菌耐SM的臨床分離株中存在正常的核蛋白S12和16Sr RNA，提示存在其它的耐藥機(jī)制［9］。

［1］劉宇紅，姜廣路，趙立平，等.第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查——結(jié)核分枝桿菌耐藥性分析與評(píng)價(jià)［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25（4）：224－227.

［2］Schatz A，Waksman S A.Effect of streptomycin and other antibiotic substances uponMycobacteriumtuberculosisand related organism［J］.Proc Soc Exp Bio Medical，1944，57：244－248.

［3］Klein M，Kimmelman L J.The role of spontaneous variants in the acquisition of streptomycin resistance by the shigellae［J］.J Bacteriol，1946，52：471－479.

［4］Ogle JM，Ramakrishnan V.Structural insights into translation fidelity［J］.Annu Rev Biochem，2005，74：129－177.

［5］Allen P N，H F Noller.Mutations in ribosomal S4 and S12 influence the higher order structure of 16S ribosomal RNA［J］.J Mol Biol，1989，208：457－468.

［6］Bohmann K，Ruusala T，Jelenc P C，et al.Kinetic impairment of restrictine streptomycin resistant ribosomes［J］.Mol Gen Genet，1984，198：90－99.

［7］Srinand S，XiPan，Stockbaner KE，et al.Characterization of rpsl and rrs mutations in streptomycin－resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from diverse geographic locatilies［J］.Antimicro Agents Chemoth，1996，40：1024－1026.

［8］Honore N，Marchal G，Cole S T.Novel Mutation in 16Sr RNA associated with streptomycin dependence in mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicro Agents Chemother，1995，39：769－770.

［9］Finken M P，Kirschner A，Meier A，et al.Molecular basis of streptomycin resistance inMycobacteriumtuberculosis：alterations of the ribosomal protein S12 gene and point mutations within a functional 16S ribosomal RNA pseudoknot［J］.Mol Microbiol，1993，9：1239－1246.