張永國，張示杰，趙江橋，張 龍，曹玉文，彭心宇，吳向未，楊宏強(qiáng)，孫 紅

抗骨橋蛋白抗體對沙鼠肝泡球蚴組織細(xì)胞因子表達(dá)的影響＊

張永國1，張示杰1，趙江橋1，張 龍1，曹玉文2，彭心宇1，吳向未1，楊宏強(qiáng)1，孫 紅1

目的 觀察抗骨橋蛋白（OPN）抗體對沙鼠肝泡狀棘球蚴組織中細(xì)胞因子表達(dá)的影響，并探討其免疫機(jī)制。方法

選長爪沙鼠30只，采用開腹直視下肝臟穿刺接種泡狀棘球蚴組織混懸液的方法建立模型后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（抗OPN抗體干預(yù)，10只）、對照組（兔血清干預(yù)，10只）和模型組（無干預(yù)，10只）。于100d后剖殺所有沙鼠，取肝泡狀棘球蚴組織，采用蘇木精－伊紅（HE）染色法和免疫組織化學(xué)SP法觀察沙鼠肝泡狀棘球蚴組織中IL－2，IL－5，IL－10及TNF－α因子的表達(dá)情況。結(jié)果 感染泡狀棘球蚴的沙鼠肝臟和腹腔中見大小不等的團(tuán)塊狀囊泡。IL－2，IL－5及TNF－α在實(shí)驗(yàn)組、對照組與模型組間免疫組化染色陽性細(xì)胞率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而實(shí)驗(yàn)組IL－10的陽性細(xì)胞率明顯低于對照組與模型組（P＜0.05）。結(jié)論 Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫與Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫共同參與了宿主抗肝泡狀棘球蚴免疫。抗OPN抗體可使IL－10的表達(dá)減低。

骨橋蛋白；抗體；肝臟；泡狀棘球蚴

肝泡狀棘球蚴?。℉epatic alveolar echinococcosis）屬惡性人獸共患寄生蟲?。?］，由多房棘球絳蟲的幼蟲寄生于肝臟并不斷增殖芽生，似癌樣浸潤擴(kuò)散，造成肝組織不可逆的進(jìn)行性損害。泡狀棘球蚴對人體來說是感染性外源性物質(zhì) ，具有抗原性，可誘發(fā)宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫［2］，針對其免疫應(yīng)答，存在著免疫保護(hù)和免疫損傷并存的復(fù)雜機(jī)制。本課題組前期研究已表明，骨橋蛋白（OPN）在肝泡狀棘球蚴纖維囊壁和炎癥細(xì)胞中高表達(dá)，可能與肝泡狀棘球蚴的生長及轉(zhuǎn)移相關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)通過外源性給予抗OPN抗體，來觀察其對肝泡狀棘球蚴組織中細(xì)胞因子表達(dá)的影響，并探討其免疫機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 多房棘球蚴和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 泡狀棘球蚴種鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；雌性6周齡長爪沙鼠（Merionesunguiculatus）30只，體重為（30±5）g，購自新疆維吾爾自治區(qū)疾控中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 鼠抗鼠OPN單克隆抗體、鼠抗鼠TNF－α單克隆抗體及鼠抗鼠IL－10單克隆抗體均購自美國Santa cruz生物科技公司；兔抗鼠IL－2多克隆抗體及兔抗鼠IL－5多克隆抗體均購自北京博奧森生物有限公司；正常兔血清本室自制；即用型免疫組化染色試劑盒（山羊抗小鼠IgG）及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑（北京中杉生物有限公司）；顯微鏡（0lympus公司，型號(hào)CX31RBSF），石蠟切片機(jī)（德國萊卡Leica2135型），圖像采集系統(tǒng)sonyExwaveHAD（日本sony公司），自動(dòng)組織包埋機(jī)LeicaEGI160（德國Leica公司）等。

1.2 方法

1.2.1 沙鼠分組 隨機(jī)分為3組，第一組單純接種泡狀棘球蚴組（模型組，10只），第二組在接種泡狀棘球蚴同時(shí)予以兔抗鼠OPN抗體干預(yù)（實(shí)驗(yàn)組，10只），第三組在接種泡狀棘球蚴同時(shí)予以兔血清干預(yù)（對照組，10只）。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 參照文獻(xiàn)［4］建立動(dòng)物模型。將人工腹腔感染泡狀棘球蚴18周的長爪沙鼠種鼠經(jīng)乙醚麻醉快速處死，無菌操作，取出腹腔中泡球蚴組織，選擇光滑、透亮、成簇游離于腹腔或附著在腹壁、腸系膜、肝表面的泡狀棘球蚴，用生理鹽水反復(fù)沖洗后，剪碎，過篩，再用生理鹽水漂洗3次，用0.5%伊紅染色，可見泡狀棘球蚴原頭蚴1～3個(gè)/視野，結(jié)構(gòu)清晰，著色率＜l5%，再加慶大霉素、青霉素注射液各250u/mL，制成20%的混合懸液用于動(dòng)物接種。分別將3組沙鼠麻醉、消毒，采用開腹直視下進(jìn)行肝內(nèi)穿刺接種，每只注射懸液0.1mL。

1.2.3 抗OPN抗體及血清注射方法 實(shí)驗(yàn)組、對照組于接種后當(dāng)天分別經(jīng)尾靜脈注射抗OPN抗體0.15mL（效價(jià)1∶32）和兔血清0.15mL，以后每隔兩日注射1次，注射方法及劑量同上，注射7次后，每隔1周注射1次。模型組無處理。普通飲食飼養(yǎng)100d后處死，摘出沙鼠肝泡狀棘球蚴組織進(jìn)行觀察。

1.2.4 觀察

1.2.4.1 病理組織學(xué)觀察 取出沙鼠肝泡狀棘球蚴組織，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察泡狀棘球蚴角質(zhì)層、生發(fā)層病理形態(tài)改變及育囊和原頭蚴發(fā)育情況。

1.2.4.2 免疫組織化學(xué)染色分析 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測沙鼠肝泡狀棘球蚴組織中IL－2，IL－5，IL－10及TNF－α因子的表達(dá)情況。每批染色以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性空白對照。IL－2，IL－5，IL－10及 TNF－α染色陽性為胞漿著色陽性。依據(jù)染色程度和陽性細(xì)胞數(shù)，參照文獻(xiàn)［5］制定判斷標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以陽性細(xì)胞的百分率來表示。整個(gè)讀片過程采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察后一起做出判斷。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果 肝組織內(nèi)見散在大小不等的泡狀棘球蚴小囊，囊壁有均質(zhì)紅染的角質(zhì)層構(gòu)成，部分囊內(nèi)壁見單細(xì)胞性的生發(fā)層，外壁附少量纖維組織及肝細(xì)胞，囊腔內(nèi)可見多個(gè)散在的原頭節(jié)，部分區(qū)可見囊液。泡壁周圍肝組織血管擴(kuò)張充血，慢性炎癥細(xì)胞浸潤（多為淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和部分嗜酸性粒細(xì)胞），單核巨噬細(xì)胞增生形成肉芽腫改變（單核細(xì)胞和多核巨細(xì)胞形成柵欄樣排列）和纖維組織增生。HE染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組、對照組、模型組間囊壁病理的改變無顯著性差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 肝臟泡狀棘球蚴 （HE染色，×200）Fig.1 Hepatic echinococcus cyst（HE stain，×200）

2.2 免疫組織化學(xué)染色分析 免疫組化染色結(jié)果顯示①肝泡狀棘球蚴組織中均可見IL－2，IL－5，IL－10及TNF－α不同程度的表達(dá)，均定位于細(xì)胞漿，主要分布在肝泡狀棘球蚴纖維囊壁的生發(fā)層、炎癥細(xì)胞和部分肝細(xì)胞中，以上細(xì)胞的細(xì)胞漿中可見黃色、棕黃色或棕褐色等陽性顆粒（圖2）。②IL－2，IL－5及TNF－α在實(shí)驗(yàn)組與對照組、實(shí)驗(yàn)組與模型組間免疫組化染色陽性細(xì)胞表達(dá)率比較無顯著性差異（P＞0.05），IL－10的陽性細(xì)胞表達(dá)率在實(shí)驗(yàn)組與對照組、實(shí)驗(yàn)組與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05）（圖3）。

圖2 肝泡狀棘球蚴IL－10免疫組化染色 （×400）A：實(shí)驗(yàn)組；B：對照組；C：空白對照組Fig.2 IL－10expression in hepatic echinococcus cyst（SP，×400）A：experimental group；B：control group；C：blank control group

圖3 四種因子在肝泡狀棘球蚴組織中的陽性細(xì)胞表達(dá)率Fig.3 Positive expression rate of four kinds of factors in hepatic echinococcus cyst

3 討 論

在寄生蟲免疫中，根據(jù)Th細(xì)胞產(chǎn)生不同細(xì)胞因子的性質(zhì)，將其分為兩個(gè)功能亞群，即Th1亞群和Th2亞群［6］。Th1細(xì)胞偏向于分泌IL－2、TNF－α和IFN－γ，可促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞偏向于分泌IL－4、IL－5、IL－6和IL－10，可增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，它們在免疫調(diào)節(jié)中互相拮抗。泡狀棘球蚴對機(jī)體來說是感染性外源性物質(zhì)，具有抗原性，可誘發(fā)宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫。在免疫應(yīng)答的過程中，OPN可能是最重要也是最早起作用的細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞趨化作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞定向的趨化活動(dòng)［7］。研究［8－9］發(fā)現(xiàn)，在炎癥組織修復(fù)及腫瘤進(jìn)展的過程中，OPN可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移和浸潤并促進(jìn)T細(xì)胞的增殖以支持機(jī)體的免疫。

本實(shí)驗(yàn)共選擇了與Th細(xì)胞有關(guān)的4種細(xì)胞因子，即Th1型細(xì)胞因子（IL－2、TNF－α）和 Th2型細(xì)胞因子（IL－5、IL－10），來探討在抗 OPN 抗體干預(yù)后，宿主對泡球蚴的免疫應(yīng)答機(jī)制。

IL－2主要是由抗原誘導(dǎo)活化的CD＋4Th1細(xì)胞產(chǎn)生，具有加強(qiáng)宿主免疫力的作用，可抑制腫瘤和寄生蟲生長。TNF－α作為Th1細(xì)胞分泌的一種免疫反應(yīng)介質(zhì)，參與多種感染性疾病的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)中，IL－2及TNF－α在實(shí)驗(yàn)組、對照組與模型組間免疫組化染色陽性細(xì)胞率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能是因?yàn)?，首先肝泡狀棘球蚴寄生部位周圍出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞浸潤，局部IL－2、TNF－α過量產(chǎn)生，其次泡狀棘球蚴本身可直接誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL－2、TNF－α。感染泡狀棘球蚴后，宿主肝臟不僅受到泡球蚴的破壞，還受到代謝性物質(zhì)的損傷，導(dǎo)致肝組織萎縮，退行性改變，以及局部和全身的免疫應(yīng)答的改變。

IL－5是由活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)B細(xì)胞生長及分化，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫。IL－10是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子合成抑制因子（CSIF），可抑制Th1細(xì)胞克隆合成細(xì)胞因子，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化和產(chǎn)生抗體，具有雙向調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)中，IL－5在實(shí)驗(yàn)組、對照組與模型組間免疫組化染色陽性細(xì)胞率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而實(shí)驗(yàn)組IL－10的陽性細(xì)胞表達(dá)率降低，與對照組和模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究表明：體內(nèi)IL－10過表達(dá)說明T細(xì)胞的免疫功能處于抑制狀態(tài)，使寄生蟲得以逃避宿主的免疫攻擊，同時(shí)避免宿主的免疫損傷，有利于寄生蟲的存活［10］。而在本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)IL－10的表達(dá)是降低的，這說明抗OPN抗體可提高沙鼠的免疫功能，使以Th2為主的免疫抑制功能有所減弱 ，Th1反應(yīng)有所增強(qiáng)。這可能因?yàn)椋嚎筄PN抗體通過結(jié)合體內(nèi)的OPN，阻礙了OPN的功能，從而抑制泡球蚴的生長，泡球蚴的增殖作用受到抑制，使宿主與寄生蟲的相互關(guān)系發(fā)生改變 ，機(jī)體的保護(hù)性免疫有所恢復(fù)，由于泡球蚴病灶未徹底治愈，故機(jī)體的免疫應(yīng)答仍處于免疫抑制狀態(tài)。

根治性肝切除是肝泡狀棘球蚴病的首選治療方式，但大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，肝內(nèi)重要血管、膽管及周圍臟器受浸，根治性切除率低，文獻(xiàn)報(bào)道僅為20%～40%［11］，未進(jìn)行治療的患者5年死亡率高達(dá)90%［12］。彭玲等研究發(fā)現(xiàn)，抗OPN抗體能通過抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性同時(shí)阻礙腫瘤血管生成，從而達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)在泡球蚴生長過程中，外源性給予抗OPN抗體，以了解宿主的免疫應(yīng)答變化及尋找抗OPN抗體干預(yù)后療效評價(jià)的免疫標(biāo)志具有重要意義，為臨床肝泡狀棘球蚴病的治療提供了線索。

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Effect of anti－osteopontin antibody on expression of cytokines in hepatic alveolar hydatid tissue of gerbil

ZHANG Yong－guo，ZHANG Shi－jie，ZHAO Jiang－qiao，ZHANG Long，CAO Yu－wen，PENG Xin－yu，WU Xiang－wei，YANG Hong－qiang，SUN Hong

（TheFirstAffiliatedHospital，MedicalCollegeofShiheziUniversity，Shihezi832008，China）

In order to observe the effect of anti－osteopontin antibody on expression of cytokines in hepatic alveolar hydatid tissue of gerbil and further discuss the mechanism of anti－osteopontin antibody action.30gerbils were infected withE.multilocularissuspension through abdominal opening injection in liver.Gerbils were randomly divided into experimental group（Anti－OPN antibody interference，ten gerbils），control group（Rabbit serum interfere，ten gerbils）and model group（No intervention，ten gerbils）.Gerbils were sacrificed at 100days post infection，Cysts were removed to observe the pathological changes resulting from HE staining，the expression of IL－2，IL－5，IL－10and TNF－αwere measured by immunohistochemistry staining（SP method）.The experiment results showed thatE.multiloculariswere spread over the liver and abdominal cavity.Immunohistochemistry staining results indicated that the IL－2，IL－5and TNF－αpositive expression rate in this three groups was no significant difference（P＞0.05），and the positive expression rate of IL－10in experimental group was significantly lower than that in the control group and model group（P＜0.05）.It was concluded that the induction of Th2antibody－mediated immunity（AMI）with a parallel expansion of Th1cell－mediated inflammatory（CMI）responese as an important mechanism of host defence against the hepatic alveolar hydatid.The anti－OPN antibodies could reduce the expression of IL－10.

osteopontin；antibody；liver；alveolar hydatid

R383.3

A

1002－2694（2011）10－0897－04

＊國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30860274）

張示杰，Email：zsj－sh＠tom.com

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，石河子 832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室

2011－06－27；

2011－08－11