王 越，楊再峰，馬 安，施曉華，陳璋輝，劉曉龍，干小仙

應(yīng)用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定日本血吸蟲蟲卵診斷抗原＊

王 越1，楊再峰2，馬 安1，施曉華1，陳璋輝1，劉曉龍1，干小仙1

目的 蟲卵可溶性抗原（soluble egg antigen，SEA）是目前日本血吸蟲病免疫診斷中最常用的抗原。本研究聯(lián)合應(yīng)用雙向凝膠電泳（2－DE）、Western blot和MALDI－TOF質(zhì)譜等技術(shù)，鑒定SEA中診斷抗原蛋白質(zhì)。方法 SEA經(jīng)2－DE分離蛋白質(zhì)后進(jìn)行銀染，或應(yīng)用日本血吸蟲感染兔血清Western blot篩選抗原蛋白點(diǎn)，用MALDI－TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜鑒定每一抗原蛋白質(zhì)分子。結(jié)果 蟲卵可溶性蛋白分子經(jīng)2－DE分離后轉(zhuǎn)印PVDF膜上，與感染兔血清孵育出現(xiàn)29個(gè)特異性陽性反應(yīng)點(diǎn)，與健康兔血清出現(xiàn)3個(gè)非特異的陽性反應(yīng)點(diǎn)；29個(gè)特異性抗陽性反應(yīng)點(diǎn)中，從銀染2－DE膠圖上找到21個(gè)匹配的抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)；MALDI－TOF/TOF質(zhì)譜鑒定和 NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，13個(gè)點(diǎn)（61.9%）獲得匹配蛋白質(zhì)，4個(gè)點(diǎn)（19.0%）獲得匹配EST，4個(gè)點(diǎn)（19.0%）未能從數(shù)據(jù)庫中找到相匹配的信息。重組表達(dá)篩選出的SjCHGC06040和SjP40兩個(gè)抗原蛋白質(zhì)，Western blot結(jié)果顯示reSjCHGC06040、reSjP40均能與感染兔血清抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)論 2－DE、MALDI－TOF質(zhì)譜聯(lián)合Western blot的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，用于篩選、鑒定SEA中診斷抗原蛋白質(zhì)，是切實(shí)可行的；但該方法存在一定的局限性，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

日本血吸蟲；蟲卵可溶性抗原；免疫蛋白質(zhì)組學(xué)

中國(guó)是日本血吸蟲肆虐最嚴(yán)重的國(guó)家，經(jīng)過幾十年的防治，大部分地區(qū)疫情得到控制或基本控制，流行區(qū)人體感染率和感染度逐步下降。但是，迄今仍有7省市存在不同程度流行，局部地區(qū)人群感染率出現(xiàn)回升，尋找更適合我國(guó)血吸蟲病流行現(xiàn)狀的防制新技術(shù)是當(dāng)前亟待研究的內(nèi)容［1］。近10年來，日本血吸蟲和曼氏血吸蟲的基因組、轉(zhuǎn)錄組研究取得重大突破，已基本完成基因組草圖，同時(shí)積累了龐大的生物信息資料［2－3］，這為血吸蟲病防制新技術(shù)研究開創(chuàng)了新局面。

糞檢蟲卵曾是最常見、最經(jīng)濟(jì)、最可靠的日本血吸蟲病查病方法。但隨著防治工作的深入，人體感染率、感染度已降至較低水平，用糞檢蟲卵等病原學(xué)查病方法從龐大的流行區(qū)人群中將感染者篩查出來，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，并且容易造成漏檢。因此，需要建立操作簡(jiǎn)易并且敏感、特異的診斷技術(shù)替代病原學(xué)檢查［4］。2008年對(duì)全國(guó)血吸蟲病免疫診斷試劑進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示9種采用蟲卵可溶性抗原（Soluble egg antigen，SEA）檢測(cè)特異性IgG抗體的方法，敏感性均在92%以上，能基本滿足人群篩查要求，但特異性為70%～97.1%不等［5］。為尋找適合新型診斷技術(shù)的特異性抗原分子，本文將經(jīng)典的高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)雙向凝膠電泳（2－DE）與Western blot相結(jié)合，從SEA中篩選抗原蛋白質(zhì)分子，再利用MALDI－TOF質(zhì)譜和血吸蟲生物信息資料鑒定抗原蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 日本血吸蟲感染陽性釘螺由江西省寄生蟲病研究所提供，逸放尾蚴前先在30～35℃恒溫箱孵育7d；健康新西蘭家兔，體重2.5～3.0kg，雄性，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 日本血吸蟲蟲卵收集 用潔凈蓋玻片蘸取新逸出的日本血吸蟲尾蚴，貼于健康家兔腹部皮膚進(jìn)行人工感染，每兔約2 000條。感染后43d剖殺，取肝臟組織，剪碎后研磨成勻漿，按Ashton PD等［6］介紹的蛋白酶消化結(jié)合不同目數(shù)的銅篩淘洗分離獲得純凈蟲卵，分裝后－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蟲卵可溶性蛋白樣本制備 取凍存的日本血吸蟲蟲卵樣品，用細(xì)胞洗滌液洗滌2～3次后，置組織勻漿器中，加入適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液反復(fù)研磨，蟲卵勻漿液移至PV管中，冰浴上超聲粉碎5min（80W×5s×5次，每次間隔10s），4℃條件下30 000g離心45min，收集上清，按Bradford法測(cè)定蛋白濃度，分裝后－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雙向電泳 采用13cm IPG 膠條（pH 3－10），上樣蛋白量300μg，水化液體積300μL。第一向等電聚焦，設(shè)置程序：30V水化12h，500V除鹽1h，1 000V除鹽1h，8 000V線性升壓8h，8 000V快速聚焦35 000Vh，500V保持任意時(shí)間。第二向SDS－PAGE：丙烯酰胺膠濃度為12%，將聚焦好的IPG膠條置于PAGE凝膠上端，與凝膠緊密相接，再用0.5%瓊脂糖/溴酚藍(lán)封膠條，220V恒壓6h。電泳結(jié)束后取下凝膠，置去離子水中漂洗2次。1個(gè)樣本1次同時(shí)同樣條件做3塊膠，2塊膠分別作電轉(zhuǎn)印，1塊膠進(jìn)行銀染色及質(zhì)譜鑒定用。

1.5 Western blot 按半干轉(zhuǎn)印儀（Trans－Blot SD Semi－Dry Transfer Cell，BIO－RAD）操作說明進(jìn)行。電轉(zhuǎn)印條件：24V/膠，30min。轉(zhuǎn)印膜浸泡于5%脫脂奶粉中，4℃封閉過夜，TBST洗滌3次，每次10min；同一樣本相同條件下電泳、轉(zhuǎn)印的2張膜，分別與1∶200稀釋的混合感染兔血清和混合健康兔血清在室溫下孵育1h，TBST洗膜3次，每次10 min；加入1∶40 000稀釋的羊抗兔IgG堿性磷酸酶標(biāo)記物，室溫孵育1h；TBST洗膜3次后加入20 mL/氯化硝基四氮唑藍(lán)（5－bromo－4－chloro－3－indolyl phosphate/nitro－blue tetrazolium chloride，BCIP/NBT）底物溶液，避光反應(yīng)10min，用20mmol/L EDTA溶液洗滌終止反應(yīng)，結(jié)果掃描保存。

1.6 質(zhì)譜鑒定

1.6.1 抗原蛋白點(diǎn)膠內(nèi)消化 根據(jù)PVDF膜上特異性陽性反應(yīng)點(diǎn)，在銀染色的2－DE膠圖上找到相匹配的抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)。手工挖點(diǎn)，用30%乙腈和100mmol/L的NH4HCO3將選定的蛋白質(zhì)點(diǎn)膠粒脫色至膠塊無色透明，吸去脫色液后低壓凍干，加入30μL含50ng胰蛋白酶的50mmol/L NH4HCO3中水化，37℃消化過夜。用含0.1%三氟乙酸的60%乙腈提取3次，收集所得肽段低壓凍干，－80℃保存待用。無蛋白的膠顆粒按上述方法處理后用作陰參，以鑒定由胰蛋白酶自體酶解產(chǎn)生的產(chǎn)物。

1.6.2 MALDI－TOF/TOF－MS/MS鑒定 MALDI－TOF/TOF質(zhì)譜鑒定：先用標(biāo)準(zhǔn)肽外標(biāo)校正ABI 4800Proteomics Analyzer質(zhì)譜儀，選定5個(gè)離子強(qiáng)度最強(qiáng)的肽段作為母離子用于MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序。質(zhì)譜儀基本參數(shù)：波長(zhǎng)為355nm，頻率200Hz，在正離子反射模式下每張圖譜為1 000次激光打擊，離子源加速電壓20kV，質(zhì)量范圍為800～4 000Da，信噪比最小值為10，本底噪音窗寬度為250m/z時(shí)自動(dòng)確定單同位素峰質(zhì)量。選定在MS/MS正離子模式下設(shè)定默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，碰撞能量2kV。所有實(shí)驗(yàn)樣品的質(zhì)譜圖均以默認(rèn)模式獲得。利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。將分析獲得的MS及MS/MS數(shù)據(jù)利用GPS搜索引擎及Matrix Science公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時(shí)查詢其功能。

1.7SjP40、SjCHGC06040抗原的重組表達(dá) 按RNA提取試劑盒操作說明書提取日本血吸蟲蟲卵總RNA。根據(jù)SjP40和SjCHGC06040的cDNA序列分別設(shè)計(jì)、合成1對(duì)引物，并插入酶切位點(diǎn)。SjP40：P1：GCGGATCC（BamH I）TTTCCGAGGCATAGACACGA，P2：GCGAATTC（EcoR I）TTATTTCTTGCCACCTGCACCAT；SjCHGC06040： P1：GCGGATCC （BamH I）AGCGAGTTTGTGC TTCACAAACC，P2：TATGCGGCCGC （NotI）TCACTTAGGTTGAT－CAATACGTACCA。以提取的總RNA為模板，應(yīng)用oligo（dT）引物和逆轉(zhuǎn)錄酶RT－PCR合成cDNA，再以此為模板，分別加入SjP40和SjCHGC06040引物，擴(kuò)增目的基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I/EcoR I （SjP40） 和BamH I/NotI（SjCHGC06040）雙酶切后連接到pET28a載體，將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞。取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布Kan陽性平板，37℃培養(yǎng)過夜。每個(gè)平板挑選10個(gè)克隆進(jìn)行Colony PCR，1%Agarose凝膠電泳驗(yàn)證重組載體。選擇Colony PCR陽性的克隆送測(cè)序檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果正確者小量培養(yǎng)抽提質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliRossetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布Kan陽性平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑選單個(gè)白色克隆，接種于LB培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)OD600達(dá)到0.8左右時(shí)加入IPTG至終濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4h后收菌。收集的細(xì)菌經(jīng)洗滌后，用細(xì)胞裂解液及超聲粉碎破菌，取上清液，采用Ni－NAT層析柱純化重組蛋白。用SDS－PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)和純化結(jié)果。

1.8 reSjP40和reSjCHGC06040抗原性檢測(cè) 純化的reSjP40和reSjCHGC06040重組蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別與anti－His單抗、感染兔血清、健康兔血清孵育，洗滌后分別與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗鼠IgG、抗兔IgG二抗孵育，BCIP/NBT底物顯色反應(yīng)10～15min。

2 結(jié) 果

2.1 2－DE和2－DE Western blot圖譜 日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原2－DE獲得＞200個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，與感染兔血清反應(yīng)的Western blot出現(xiàn)29個(gè)陽性反應(yīng)點(diǎn)，與健康兔血清孵育反應(yīng)出現(xiàn)3個(gè)假陽性點(diǎn)（由紅色虛線圈標(biāo)示）；29個(gè)陽性反應(yīng)點(diǎn)在相應(yīng)2－DE膠圖上找到21個(gè)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)；其中81.0%（17/21）抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)分子量主要分布在31～66.2kDa之間，5個(gè)抗原點(diǎn)分子量在14.4～20.1kDa之間；8個(gè)（26.7%）陽性反應(yīng)點(diǎn)未能在2－DE膠圖上找到匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)。

2.2 抗原蛋白質(zhì)點(diǎn) MALDI－TOF/TOF－MS/MS分析及搜庫結(jié)果 21個(gè)抗原蛋白點(diǎn)經(jīng)MALDITOF質(zhì)譜鑒定，13個(gè)點(diǎn)（61.9%）從NCBI數(shù)據(jù)庫找到匹配蛋白質(zhì)，相關(guān)信息資料詳見表1；4個(gè)點(diǎn)（13、16、18、21）僅從NCBI EST數(shù)據(jù)庫找到匹配的序列；4個(gè)點(diǎn)（9、15、19、20）未能從數(shù)據(jù)庫中找到相匹配的信息，占19.0%。

2.3SjP40和SjCHGC06040抗原基因重組表達(dá)SjP40和SjCHGC06040基因經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生分別為744bp和909bp的片段，并成功克隆至pET28a載體。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序后與SjP40（GI：226477158）和SjCHGC06040（GI：76156146）序列進(jìn)行比對(duì)，同源性分別達(dá)到99.6%和99.0%。轉(zhuǎn)化后的E.coli表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)預(yù)期分子量的重組蛋白，結(jié)果見圖2。

2.4 reSjP40和reSjCHGC06040免疫印跡結(jié)果純化的reSjP40和reSjCHGC06040均與日本血吸蟲感染兔血清有較強(qiáng)反應(yīng)，而與健康兔血清未見反應(yīng)，見圖3。

圖1 日本血吸蟲可溶性抗原2－DE膠圖和Western blot結(jié)果A：日本血吸蟲可溶性抗原2－DE膠圖譜，1－21數(shù)字箭頭所指為匹配的抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)；B：PVDF膜與混合感染兔血清反應(yīng)的Western blot結(jié)果，1－29數(shù)字箭頭所指為陽性反應(yīng)點(diǎn)；C：與混合健康兔血清Western blot結(jié)果，虛線圈內(nèi)為假陽性點(diǎn)。Fig.1 Silver－stained 2－DE gels of S.japonicumsoluble egg antigens（A）and corresponding Western blot results of reactivity with pooled infective rabbit sera（B），and pooled normal rabbit sera（C）.

表1 日本血吸蟲蟲卵抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 Identification of proteins in S.japonicumsoluble egg antigens by MALDI－TOF/TOF MS/MS

3 討 論

早在1975年O’Farrell應(yīng)用雙向電泳成功地分離E.coli蛋白分子，得到類似的蛋白圖譜，受當(dāng)時(shí)技術(shù)上限制，不能做膠上蛋白鑒定［7］。20年后生物質(zhì)譜和生物信息學(xué)的發(fā)展，才使膠上蛋白質(zhì)鑒定成為可能，蛋白質(zhì)組學(xué)迅速發(fā)展。Jungblut PR等率先將雙向凝膠電泳（2－DE）和 Western blot聯(lián)合應(yīng)用，成功鑒定伯氏疏螺旋體的抗原蛋白質(zhì)，并于2001年提出免疫蛋白質(zhì)組學(xué)（Immuno－proteomics）概念［8－9］。此后免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲及腫瘤細(xì)胞抗原蛋白質(zhì)組研究，形成一門新興交叉學(xué)科。高分辨率的蛋白質(zhì)分離方法是蛋白質(zhì)組學(xué)及免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)關(guān)鍵，2－DE是最經(jīng)典也是目前最常用的蛋白質(zhì)分離方法。從最初一塊膠分離1 000個(gè)蛋白質(zhì)，發(fā)展到現(xiàn)在一塊34cm×24cm大膠可同時(shí)分離10 000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)［10］。Mathieson W 和 Wolson RA 用2－DE分離曼氏血吸蟲成熟卵可溶性抗原（SEAd），獲得686個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)［11］。本研究采用13cm（pH 3－10）IPG膠條等電聚焦和15cm×16cm SDS－PAGE電泳分離日本血吸蟲SEA，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)點(diǎn)在200個(gè)以上，證明有較好的分離效果。將2－DE膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用感染兔血清作Westerrn blot獲得29個(gè)特異性陽性反應(yīng)點(diǎn)，并在2－DE膠圖上找到21個(gè)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)，匹配成功率為72.4%，提示該方案篩選抗原蛋白質(zhì)是切實(shí)可行的。

日本血吸蟲成蟲寄生在宿主腸系膜靜脈內(nèi)，每天產(chǎn)出大量蟲卵，許多不能排出體外的蟲卵沉集在肝臟、腸道等組織中。成熟蟲卵中的毛蚴不斷向組織釋放蟲卵可溶性抗原，誘發(fā)宿主產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，形成蟲卵肉芽腫，隨后繼發(fā)纖維化。這是血吸蟲病的重要致病機(jī)理，蟲卵可溶性抗原是其主要的致病因子。因此，鑒定和分析蟲卵可溶性抗原分子對(duì)血吸蟲病免疫治療、免疫診斷以及疫苗研究具有重要意義。Abdel－Hafeez等［12］應(yīng)用二維高效液相色譜聯(lián)合dot－ELISA從SEA和成蟲可溶性抗原（SWAP）中篩選和鑒定具有疫苗研究?jī)r(jià)值的抗原蛋白，結(jié)果分別獲得107個(gè)和18個(gè)抗原蛋白質(zhì)，可見SEA中抗原蛋白質(zhì)數(shù)量明顯高于SWAP。本研究用2－DE聯(lián)合Western blot方法用感染兔血清抗體從SEA中分離篩選診斷抗原蛋白質(zhì)，獲得21個(gè)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)，明顯多于Zhong ZR等［13］采用同樣2DE－Western blot從成蟲可溶性抗原（AWA）分離篩選獲得的抗原蛋白質(zhì)數(shù)。雖然2－DE是目前蛋白質(zhì)組研究中首選的分離方法，在腫瘤、自身免疫性疾病免疫蛋白質(zhì)組研究中應(yīng)用較多，但是用于血吸蟲抗原性蛋白質(zhì)分離存在一些局限性，分離篩選到的抗原蛋白質(zhì)數(shù)較少，這主要與2－DE的第二向SDSPAGE電泳中使蛋白質(zhì)二硫鍵打開、變性有關(guān)，蛋白分子成為線性分子，導(dǎo)致抗原空間構(gòu)像表位被破壞，大多數(shù)的抗原分子被漏檢。

2－DE膠上21個(gè)抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng) MALDITOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜和查庫檢索，61.9%（13/21）獲得匹配蛋白質(zhì)信息；有8個(gè)點(diǎn)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索失敗，其中4個(gè)點(diǎn)在dbEST數(shù)據(jù)庫檢索中獲得有意義的匹配，僅4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（19.0%）兩庫檢索均失敗。隨著日本血吸蟲、曼氏血吸蟲基因組計(jì)劃的完成，血吸蟲轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組研究不斷深入，血吸蟲生物信息資料不斷得到完善，抗原蛋白質(zhì)分子的鑒定成功率也將進(jìn)一步提高。已鑒定的13個(gè)抗原蛋白分子中，38.5%（5/13）是70kDa熱休克蛋白（HSP70）。從2－DE膠圖上可見這些蛋白質(zhì)點(diǎn)分子量基本相同，只是pI有微小變化，推測(cè)是蛋白分子修飾不同引起pI差異。SEA中主要蟲卵抗原P40（major egg antigen，SjP40）也是高豐度蛋白質(zhì)，已有研究證明曼氏血吸蟲、日本血吸蟲的主要蟲卵抗原P40具有較好的抗原性和診斷價(jià)值［14－15］。本研究根據(jù)質(zhì)譜鑒定取得的抗原基因信息，分別構(gòu)建SjP40、SjCHGC06040原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得的reSjP40、reSjCHGC06040經(jīng)Western blot驗(yàn)證具有較好的抗原性。其中reSjCHGC06040印跡圖中出現(xiàn)的3條帶可能為降解的蛋白引起。已鑒定的其它抗原蛋白質(zhì)分子有待進(jìn)一步驗(yàn)證和開發(fā)利用。

2－DE、Western blot和 MALDI－TOF質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定相結(jié)合是最經(jīng)典的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)路線，已廣泛應(yīng)用于腫瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病研究［16－18］。但是，2－DE 用于血吸蟲抗原性蛋白質(zhì)分離存在一些局限性，如血吸蟲膜蛋白是理想的抗原分子，但其多為疏水性蛋白，不適合用2－DE進(jìn)行分離；盡管現(xiàn)有的2－DE靈敏度能達(dá)到ng級(jí)，但一些低豐度蛋白質(zhì)仍無法檢測(cè)到，因此常見免疫印跡圖上一些陽性反應(yīng)點(diǎn)，在膠圖上卻找不到匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)，本研究有8個(gè)陽性點(diǎn)未能在膠圖上找到匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)，匹配率為72.4%。高豐度蛋白質(zhì)大多是一些結(jié)構(gòu)蛋白，無抗原性，往往低豐度蛋白抗原性特別強(qiáng)，可能是理想的診斷抗原；2－DE中第二向電泳中SDS為變性劑，使樣本中所有蛋白質(zhì)分子的二硫鍵打開成為線性分子，部分抗原決定簇被破壞而失去抗原性，在免疫篩檢時(shí)被漏檢。近年來多維高效液相色譜、免疫親和層析、噬菌體展示等蛋白質(zhì)分離方法陸續(xù)應(yīng)用免疫蛋白質(zhì)組研究，避免上述2－DE蛋白質(zhì)分離技術(shù)上不足，可以應(yīng)用于血吸蟲免疫蛋白質(zhì)組研究。

（對(duì)上海中科新生命生物科技有限公司呼建文、丁偉等工作人員在蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)研究中給予技術(shù)上幫助表示誠(chéng)摯的感謝?。?/p>

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Identification of diagnostic antigens fromSchistosomajaponicumeggs with immunoproteomic approach

WANG Yue，YANG Zai－feng，MA An，SHI Xiao－h(huán)ua，CHEN Zhang－h(huán)ui，LIU Xiao－long，GAN Xiao－xian

（InstituteofParasiticDiseases，ZhejiangAcademyofMedicalSciences，Hangzhou310013，China）

In order to identify useful candidate antigens for diagnosis of schistosomiasis，two－dimensional electrophoresis（2－DE）technology combined with Western blot and MALDI－TOF/TOF－MS/MS spectrometry were applied to analyse soluble egg antigen（SEA）ofSchistosomajaponicum.After being extracted from eggs，soluble proteins were separated by 2－DE.The gels were used for sliver staining or reacted withS.japonicuminfected rabbit sera to screen antigenic proteins by Western blot.Each antigenic molecule identified by MALDI－TOF/TOF－MS/MS.There were 29spots showed on the PVDF membrane that incubated with infected rabbit sera，while 3non－specific spots were reacted with normal rabbit sera.Twenty－one of these 29positive spots were precisely matched with a homologous 2－DE gel.After identified by MALDI－TOF/TOF－MS/MS technique and searched in NCBI database，13molecules were successfully matched with protein database and 4were EST data，while 4were failed.Of these proteins，SjP40andSjCHGC06040were successfully expressed，and Western blot results showed a specific reaction between the recombinant proteins and infected rabbit sera.Therefore，our data suggests the immunoproteomic approach is a suitable method for screening and identification of diagnostic candidate antigens from eggs ofS.japonicum.

Schistosomajaponicum；soluble egg antigen；immunoproteomics

R383.2

A

1002－2694（2011）10－0861－05

＊浙江省科技廳專項(xiàng)基金（2007F10029）資助

干小仙，Email：xiaoxian＿gan＠hotmail.com

1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所，杭州 310013；2.浙江省醫(yī)學(xué)科技教育發(fā)展中心，杭州 310006

2011－05－06；

2011－06－19